Главная страница
Навигация по странице:

  • Введение 4 Эндоцитоз 30 Клетки плоского эпителия полости рта человека 30 Пути клеточной гибели 61 Соединительные ткани 71

  • Мышечная ткань. Нервная ткань 89 Миелиновые нервные волокна 100 Введение

  • Иванова Анна Николаевна Горбанева Тамара Борисовна Цитология с основами гистологии Лабораторный практикум



    Скачать 26.63 Mb.
    НазваниеИванова Анна Николаевна Горбанева Тамара Борисовна Цитология с основами гистологии Лабораторный практикум
    АнкорTsitologia_labor_praktikum_ispravlenny__201.doc
    Дата04.05.2018
    Размер26.63 Mb.
    Формат файлаdoc
    Имя файлаTsitologia_labor_praktikum_ispravlenny__201.doc
    ТипПрактикум
    #20168
    страница1 из 9

    Подборка по базе: Информационные технологии.Этапы развития ИТ.Вилкова Анна ПДН116..
      1   2   3   4   5   6   7   8   9


    Федеральное агентство по образованию

    Федеральное государственное образовательное учреждение

    высшего профессионального образования

    «Сибирский федеральный университет»


    Авторы
    Голованова Тамара Ивановна
    Иванова Анна Николаевна
    Горбанева Тамара Борисовна

    Цитология с основами гистологии
    Лабораторный практикум


    Красноярск

    2013


    Аннотация
    Изложены методические указания к лабораторному практикуму по общему курсу «Цитология с основами гистологии», который читается студентам всех специальностей биологического направления. Методические указания составлены в соответствии с программой курса “Цитология с основами гистология” и являются основным учебно-методическим руководством по проведению его лабораторного практикума. В задачи практикума входит закрепление теоретических знаний, полученных на лекциях, изучение с помощью микроскопа и зарисовки клеток и тканей животного и растительного происхождения, приобретения навыков самостоятельного изготовления микроскопических препаратов.


    Введение 4

    Эндоцитоз 30

    Клетки плоского эпителия полости рта человека 30

    Пути клеточной гибели 61

    Соединительные ткани 71

    Мышечная ткань. Нервная ткань 89

    Миелиновые нервные волокна 100

    Введение


    При подготовке специалистов-биологов среди общих биологических дисциплин важное место занимает цитология – наука о строении и функциях клетки. Цитология – наука экспериментальная, поэтому в учебном плане подготовки биологов, кроме лекционного времени, по данной дисциплине отводится время на лабораторные занятия.

    В задачи лабораторного практикума по цитологии с основами гистологии входят: проверка и закрепление теоретических положений, излагаемых в лекционных курсах и учебниках; ознакомление со строением клеток и тканей животных и растений; знакомство и работа с современными световыми микроскопами; получение навыков научно-исследовательской работы, способности описывать и обобщать полученный материал; приобретение навыков приготовления препаратов как временных, так и постоянных, формирование общенаучных, инструментальных и общепрофессиональных компетенций.

    Лабораторные занятия выполняются индивидуально. Лаборатории должны быть оснащены современными световыми микроскопами: люминесцентный AxioImager.D1, проходящего и отраженного света AxioImager D1; микроскопы Axiostar plus производство ZEIZZ; санными микротомами НМ 430; спектрофотометрами Analytik jena SPEKOL 1300 для ознакомления с разнообразными клетками, тканями, процессами деления клеток, интерактивными техническими средствами обучения, компьютерной техникой для проверки знаний тестированием UniTest версии 3.0.0.

    К лабораторному практикуму студент допускается только после инструктажа по технике безопасности. Основные положения техники безопасности изложены в инструкциях, которые должны находиться на видном месте в лаборатории.


    Правила работы с микроскопом


    Микроскоп необходимо содержать в чистоте и предохранять от повреждений. В нерабочем состоянии микроскоп должен быть накрыт чехлом. Особое внимание следует обращать на чистоту объективов и других оптических деталей.

    ВНИМАНИЕ! Нельзя касаться пальцами поверхностей линз. Для предохранения оптических деталей визуальной насадки от пыли следует оставлять окуляры в тубусах или надевать на них колпачки.

    Оптические поверхности окуляров, объективов и конденсора можно осторожно протирать чистой ватой, навернутой на деревянную палочку и смоченной специальной жидкостью для чистки оптических деталей. При загрязнении внутренних поверхностей линз объектива необходимо объектив отправить для чистки в оптическую мастерскую.

    ВНИМАНИЕ! Запрещается самим разбирать объективы, окуляры, конденсор.

    Рассмотрим важнейшие погрешности при работе с микроскопом, чтобы начинающие исследователи не допускали их с самых первых шагов, добиваясь таким образом максимального использования возможностей микроскопа. К таким ошибочным действиям необходимо отнести следующие действия:

    одновременное применение вогнутого зеркала и конденсора, что нарушает принцип освещения препарата;

    использование высокоапертурных конденсоров с NA = 1,2 – 1,4 с низкоапертурными объективами с NA = 0,2 – 0,4, ухудшающих качество изображения. Для устранения этой ошибки следует предварительно уменьшить нумерическую апертуру конденсора путем снятия (отвинчивания) его верхней линзы;

    произвольное опускание конденсора без учета толщины предметного стекла может привести к появлению артефактов;

    регулировка освещенности поля зрения микроскопа при помощи опускания и поднятия конденсора поскольку это влияет на качество изображения;

    произвольное изменение величины отверстия апертурной диафрагмы конденсора с целью регулировки освещенности поля зрения микроскопа;

    пренебрежение нейтральными светофильтрами и матовыми стеклами для регулировки освещенности поля зрения микроскопа, что ухудшает восприятие препарата и может оказывать отрицательное влияние на зрение исследователя;

    применение толстых предметных стекол (толще 1, 2 мм), что препятствует правильной установке освещения при высокоапертурных объективах, поскольку при этом не удается сфокусировать конденсор на объекте;

    применение покровных стекол несоответствующей толщины (толще или тоньше 0,17 мм);

    пренебрежение созданием полной иммерсии при работе с объективами, имеющими нумерическую апертуру более 1,2, что не позволяет полностью использовать нумерическую апертуру объектива.

    Меры безопасности при работе с микроскопом


    При работе с микроскопом с осветителем следует соблюдать меры безопасности, соответствующие мерам, принимаемым при эксплуатации электроустановок напряжением до 1000 В.

    ВНИМАНИЕ! Замену лампы в осветителе микроскопа производить только при отключении от электрической сети. Во избежание ожога кожи рук о колбу лампы или контактные пластины патрона замену лампы следует производить через 15 – 20 мин после ее перегорания.

    Замену плавкой вставки (предохранителя) в микроскопе следует производить при отключенном от сети микроскопе.

    После работы на микроскопе с осветителем необходимо отключить его от сети.

    Не рекомендуется оставлять без присмотра включенный в сеть микроскоп.

    Устройство микроскопа


    Микроскоп представляет собой оптический прибор, дающий увеличенное изображение мелких объектов и их деталей. Хотя различные марки световых микроскопов имеют конструктивные отличия, в каждом из них существуют оптические и механические узлы.

    Устройство микроскопа наглядно показано на Рис. 1.



    Рис. 1. Устройство микроскопа Primo Star: 1 – окуляры; 2 – бинокулярная насадка; 3 – револьверное устройство; 4 – объектив; 5 – предметный столик; 6 – конденсор; 7 – показатель интенсивности освещения; 8 – включение и выключение микроскопа; 9 – рук

    оятка грубой фокусировки; 10 – рукоятка тонкой фокусировки; 11- рукоятка перемещения предметного столика

    Оптический узел составляют осветительная система (конденсор и зеркало), объективы и окуляры вместе с тубусом, все составные части строго центрированы одна в отношении другой.

    Механический узел микроскопа состоит из штатива, на котором крепятся оптические детали, предметного столика и механизмов фокусировки микроскопа.

    Настройка освещения микроскопа с вынесенным осветителем


    В соответствии с принципом Келера при установке освещения для микроскопа типа МБИ-3, а также микроскопов серии Микмед с вынесенным осветителем необходимо руководствоваться следующими правилами:

    1. Устанавливают осветитель ОИ-19 (или ОИ-9м) перед микроскопом с помощью соединительной планки, что обеспечивает нормальное расстояние микроскопа от осветителя. Включают его через трансформатор в сеть и, поворачивая корпус, направляют световой поток на плоскоезеркало микроскопа.

    2. Поднимают конденсор микроскопа в верхнее положение и полностью закрывают его диафрагму.

    3. Уменьшают диаметр отверстия ирисовой диафрагмы осветителя до 1 – 2 мм.

    4. Перемещая патрон лампочки осветителя вдоль оси и одновременно поворачивая зеркало микроскопа и корпус осветителя, добиваются получения изображения нити лампочки на закрытой диафрагме конденсора. При этом центр изображения нити лампочки должен находиться в центральной части ирисовой диафрагмы.

    5. Открывают отверстие диафрагмы конденсора и осветителя.

    6. Уменьшают яркость свечения нити лампочки при помощи реостата.

    7. Помещают исследуемый препарат на предметный столик микроскопа, ставят необходимый объектив в рабочее положение и, глядя в окуляры бинокулярной насадки микроскопа, перемещением тубуса фокусируют оптику микроскопа на объект.

    8. Почти полностью закрывают диафрагму осветителя и перемещением конденсора добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа.

    9. Поворотом зеркала центрируют изображение диафрагмы осветителя, а затем открывают ее настолько, чтобы изображение диафрагмы было равно (или немного больше) полю зрения микроскопа.

    10. Вынимают один окуляр и, глядя в тубус микроскопа, уменьшают диафрагму конденсора до едва заметного появления ее краев на фоне светлого кружка задней линзы объектива.

    11. Помещают окуляр на место. В прорези осветителя вставля­ют синее и матовое стекла. Затем, глядя в микроскоп, при помощи реостата осветителя устанавливают необходимую освещенность препарата.

    12. Исследуют препарат.

    Примечания.

    1. При работе с низкоапертурными объективами малого увеличения (10х и меньше) перед настройкой освещения устанавливают сменный низкоапертурный конденсор или, если это позволяет конструкция конденсора, отделяют (отвинчивают) его верхнюю линзу.

    2. Пункт 7 можно выполнить в самом начале при произвольно установленном освещении, а затем внести коррективы в соответствии с принципом Келера.

    Настройка освещения микроскопа с встроенным в основание осветителем


    Порядок настройки микроскопа со встроенным осветителем:

    1. Устанавливают матовое стекло в откидную рамку конденсора.

    2. Вводят в ход лучей объектив меньшего увеличения (10х и менее).

    3. Вводят в ход лучей матовое стекло и откидную линзу конденсора.

    4. Поднимают рукояткой кронштейн с конденсором до упора и полностью раскрывают апертурную диафрагму конденсора.

    5. Устанавливают патрон с лампой в шарнир до упора.

    6. Устанавливают лампу таким образом, чтобы ее нить располагалась горизонтально.

    7. Подключают источник питания к сети и включают лампу.

    8. Фокусируют микроскоп на резкое изображение препарата, установленного на предметном столике.

    9. Перемещая патрон с лампой за рукоятку вдоль оси и разворачивая его вместе с шарниром в горизонтальной плоскости, добиваются наиболее яркого и равномерного освещения поля зрения микроскопа.

    10. При работе с другим объективом повторяют настройку освещения.

    11.ВНИМАНИЕ! При работе с объективами с увеличением более 10х откидная линза конденсора должна быть выведена из хода лучей.

    Приготовление постоянных и временных препаратов


    Постоянные препараты являются прекрасным демонстрационным материалом и могут храниться долгие годы. На тонких срезах толщиной 10-22 микрона можно наблюдать проникновение пыльцевых трубок, подсчитывать число хромосом, изучать митоз и мейоз, развитие зародыша и так далее.

    Техника приготовления окрашенных микропрепаратов включает в себя несколько этапов. Объекты претерпевают сложную обработку.

    1. Подготовка материала к фиксации.

    2. Фиксирование материала водным или спиртовым фиксатором ( 24 часа и до 12 часов соответственно).

    3. Промывка зафиксированного материала.

    4. Полное обезвоживание промытого материала.

    5. Пропитывание материала растворителями парафина (хлороформом, ксилолом или бензолом).

    6. Пропитывание материала парафином до полного испарения хлороформа (или ксилола).

    7. Заливка материала в парафин (материал, залитый в парафин, можно хранить очень долго).

    8. Изготовление блоков из материала, пропитанного парафином.

    9.Получение срезов при помощи микротома.

    10. Наклейка срезов на предметные стекла.

    11. Просушивание препаратов при температуре 40 – 45о С, стекла со срезами можно хранить долго, оберегая их от пыли и высокой температуры.

    12. Удаление парафина из срезов ксилолом.

    13. Удаление ксилола из срезов спиртом.

    14. Удаление спирта из срезов дистиллированной водой.

    15. Окрашивание препаратов (иногда протравливание и окрашивание) и дифференцировка.

    16. Обезвоживание окрашенных срезов 96%-ным и 100%-ным спиртами.

    17. Замещение спирта в срезах на ксилол (одновременно происходит просветление срезов ксилолом).

    18. Заключение срезов в канадский бальзам.

    19. Просушивание и подчистка, этикетирование препаратов.

    20. Изучение препаратов под микроскопом.

    Также широко распространены в микроскопической технике давленые препараты, для изготовления которых не требуется сложной процедуры обезвоживания, заключения в промежуточную жидкость, в парафин и получения микротомных срезов. Давленые препараты применяют при изучении митоза, кариотипов и при работе с животными объектами.

    Наиболее часто для приготовления давленых препаратов применяют различные фиксаторы. Зафиксированный материал промывают в 70 %-ном спирте. В нем можно сохранять материал в течение длительного времени, но лучше хранить в холодильнике. При изготовлении давленых препаратов исключительное значение имеют способы мацерации тканей. Обычно для этого используют 45 %-ную уксусную кислоту, 40 – 45 %-ную пропионовую кислоту, 1 н. соляную кислоту, энзимы.

    Окрашивают препараты ацетокармином, реактивом Шиффа, нигрозином и другими красителями.

      1   2   3   4   5   6   7   8   9


    написать администратору сайта