- Практична робота Дослід 1. Визначення ДНК за фосфором.
- Матеріальне забезпечення
- Клініко –діагностичне та практичне значення.
- Дослід 2. Аналіз екстрактів антибіотиків методом тонкошарової рідинної хроматографії (ТШХ).
- М атеріальне забезпечення
- Контроль виконання лабораторної роботи
- Приклади тестів „ Крок –1”
- Індивідуальна самостійна робота студентів 1. Сучасні методи дослідження ДНК і РНК, їх клінічне значення. Література
- Змістовий модуль № 13. Основи молекулярної генетики.
- Практична робота Дослід № 1. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР).
- Клініко -діагностичне та практичне значення.
- Приклади тестів „Крок –1”
- Тема самостійної індивідуальної роботи для студентів
- Література
Біохімія Модуль 4 Тема 3, 4. Тема Дослідження реплікації ДНК та транскрипції рнк. Аналіз механізмів мутацій, репарацій ДНК. Засвоєння принципів отримання рекомбінантних днк, трансгенних білків. Мета заняття
 Скачать 1.53 Mb.
|
|
Тема № 3. Дослідження реплікації ДНК та транскрипції РНК. Аналіз механізмів мутацій, репарацій ДНК. Засвоєння принципів отримання рекомбінантних ДНК, трансгенних білків. Мета заняття: Знати закономірності матричного синтезу нуклеїнових кислот, етапи цих процесів, механізми мутацій, репарацій та виникнення і розвитку спадкових захворювань. Засвоїти механізм дії антибіотиків та інших інгібіторів синтезу нуклеїнових кислот. Вміти кількісно визначити вміст ДНК у біологічному матеріалі. Актуальність теми: В процесі біосинтезу нуклеїнових кислот можливі різноманітні порушення нуклеотидної послідовності під впливом фізичних (нагрівання, іонізуючі, корпускулярні опромінення), хімічних (мутагени) та біологічних (віруси) факторів. У медичній практиці широко використовуються фармацевтичні препарати, що інгібують біосинтез нуклеїнових кислот у прокаріотичних організмах та гальмують поділ клітин пухлин у онкологічних хворих. Конкретні завдання:
Теоретичні питання
Практична робота Дослід 1. Визначення ДНК за фосфором. Принцип методу. Метод грунтується на отриманні вільних нуклеїнових кислот із наступним визначенням кількості ДНК за фосфором, що утворюється у формі фосфату після мінералізації (спалювання) ДНК. Визначення фосфору проводять фотоколориметрично за реакцією з амонію молібдатом за присутності відновника (аскорбінова кислота). Інтенсивність забарвлення продукту реакції – молібденової сині – є пропорційною кількості фосфору у пробі. Матеріальне забезпечення: Тканина печінки щурів, 1 н розчин натрію гідроксиду (NaOH), 30 % розчин натрію гідроксиду (NaOH), насичений розчин натрію хлориду (NaCl), 20 % розчин ацетатної кислоти (CH3COOH), етиловий спирт, 5 % розчин ТХАК, концентрована сульфатна кислота (H2SO4), 30 % розчин гідрогену пероксиду (Н2О2), стандартний розчин калію дигідрогенфосфату (КН2РО4) 0,01 мг/мл, 2,5 % розчин амонію молібдату ((NH4)2MoO4), 1 % розчин аскорбінової кислоти, центрифуга, ФЕК, пробірки центрифугові, скляні палички, колба К’єльдаля, конічна колба, льодяна баня, пісчана баня. Хід роботи: 1. Оброблення тканин основою. Наважку тканини печінки масою 100 мг нагрівають з 1 мл 1 н розчину натрію гідроксиду у центрифужній пробірці протягом 15 хв на киплячій водяній бані. Періодично вміст пробірки перемішують скляною паличкою. 2. Послідовне осадження білків і ДНК. Пробу поступово охолоджують за кімнатної температури, а потім за температури 0С (лід). До охолодженого гідролізату додають 0,5 мл насиченого розчину натрію хлориду у 20 % розчині ацетатної кислоти для осадження білків. Осаджений білок видаляють через 5 хв шляхом центрифугування протягом 5 хв за швидкості 5000 об/хв. Центрифугат зливають у центрифужну пробірку (під час охолодження на льоду), додають до нього 6 мл етилового спирту і витримують протягом 1 год на холоді для повного осадження ДНК. Ще раз центрифугують протягом 5 хв за швидкості 5000 об./хв. Осад ДНК відмивають 5 мл 5% розчину ТХАК. 3. Визначення ДНК за фосфором. Осад ДНК кількісно переносять у колбу К’єльдаля, додають 1,5 мл сульфатної концентрованої кислоти і нагрівають (мінералізують) на пісчаній бані до повного освітлення розчину. Для прискорення мінералізації до розчину обережно додають декілька крапель 30 % розчину гідрогену пероксиду (по одній краплі). Після закінчення мінералізації рідину з колби К’єльдаля кількісно (вимірюючи об’єм) переносять у колбу Ерленмеєра. Розчин нейтралізують 30 % розчином натрію гідроксиду за допомогою універсального індикатора. Отриманий мінералізат переносять кількісно у мірну колбу на 50 мл і доводять до позначки дистильованою водою. З колби у пробірку відбирають 5 мл розчину, додають 0,5 мл 2,5 % розчину амонію молібдату, 0,5 мл 1 % розчину аскорбінової кислоти і 4 мл дистильованої води. Через 10 хв вимірюють оптичну густину розчину проти води за червоного світлофільтра (довжина хвилі 670 нм) у кюветах завтовшки 5 мм. Вміст фосфору визначають у мікрограмах за калібрувальною кривою. Для побудови калібрувального графіка використовують стандартні розчини калію дигідрогенфосфату, які містять відповідно 1, 2, 3, 4 мкг фосфору в 1 мл проби. На осі абсцис відкладають значення концентрацій стандартних розчинів, а на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини. Вміст ДНК визначають у мг% за формулою: С = а х 10, де С– вміст ДНК ( мг%), а – концентрація фосфору (мкг/мл), 10– коефіцієнт перерахунку. Нормальний вміст ДНК у печінці щурів становить 25–35 мг на 100 г. Пояснити отриманий результат. Зробити висновок. Клініко–діагностичне та практичне значення. Визначення кількості ДНК у тканинах пухлини використовують для оцінки прогнозу онкологічних захворювань та можливої індивідуалізації наступного лікування. Крім того, виділюють ДНК з клінічних зразків ( біоптати тканин, крапля крові, сперма, слиз жіночих статевих органів, осад сечі, волосся людини, зішкреби епітеліальних клітин тощо) для ланцюгової полімеразної реакції в діагностиці вірусних та спадкових хвороб людини, ідентифікації особини ("ДНК–діагностика") тощо. При доклінічному експериментальному дослідженні новостворених фармпрепаратів вивчають їх безпосередній вплив як на клітинні органели (ядро, мітохондрії тощо), так і їх компоненти. Тому, в разі отримання субклітинних фракцій клітин, необхідний суворий контроль за їх чистотою і гомогенністю. Однією з головних причин забруднення цитоплазматичних фракцій ядерним матеріалом (а саме, ДНК) є неякісна гомогенізація, що призводить до руйнування ядер. Для оцінки чистоти отриманих цитоплазматичних фракцій у них кількісно визначають ДНК. Дослід 2. Аналіз екстрактів антибіотиків методом тонкошарової рідинної хроматографії (ТШХ). Принцип методу ТШХ базується на різниці в швидкості рухливості хімічних сполук у суміші, що є нанесеними на сорбент при їхньому переміщені в потоці рухомої фази (суміш розчинників). В якості сорбентів використовують дрібнозернистий силікагель, Аl2О3, целюлозу, крохмаль, поліамід, тощо. Для тонкошарової рідинної хроматографії антибіотиків використовується суміш розчинників: хлороформ – етанол – метанол - вода у співвідношенні (120:25:6:4,5). Важливо, щоб суміш знаходилась у посудині із щільно закритою притертою кришкою. Суміш готується за добу до виконання досліду для повного насичення посудини парами розчинників. М  атеріальне забезпечення: посудина з розчинниками, силікагелеві пластинка, суміш антибіотиків, мікропіпетки.Хід роботи: 1. Приготувати силікагелеві хроматографічні пластинки на алюмінієвій основі (Merck UV259). Відступивши 1–1,5 см від нижнього краю, нанести олівцем лінію старту, позначивши через 1 см місця нанесення зразків та підписати їх. 2. Нанести зразки антибіотиків на хроматографічну пластинку, постійно випаровуючи розчинник. 3. Поставити пластинку зі зразками на дно хроматографічної посудини та щільно закрити кришкою. 4. Хроматографічне розділення проводити доти, доки фронт системи розчинників не сягне верхнього краю пластинки. 5  . Провести аналіз отриманої хроматограми. Відзначити плями кольорових сполук та порівняти їхнє забарвлення та рухливість (Rf). Визначити на скільки фракцій розділяться окремі зразки. Роздивитися хроматограму в ультрафіолетовому світлі та відмітити олівцем сполуки, які не простежуються при видимому світлі.Розміщення зони речовини на хроматографії характеризується значенням Rf, що відповідає відношенню відстані від стартової лінії до центру зони речовини до відстані від стартової лінії до лінії фронту розчинників. Значення Rf є постійною величиною для даної речовини у даній системі розчинників. За цим значенням проводять ідентифікацію компонентів суміші. Контроль виконання лабораторної роботи
А. Пуринові основи В. Піримідинові основи С. Пуринові нуклеозиди D. Піримідинові нуклеозидиЕ. Фосфатні залишки
Приклади тестів „ Крок–1” 1. Із нітратів, нітритів і нітрозамінів в організмі утворюється азотиста кислота, яка зумовлює окисне дезамінування азотистих основ нуклеотидів. Це може призвести до точкової мутації – заміни цитозину на: А. Тимін В. Урацил С. Аденін D. Гуанін E. Інозин 2. У пацієнта діагностовано СНІД. У його лейкоцити потрапила РНК вірусу СНІДу, де за участю ферменту ревертази розпочався синтез вірусної ДНК. Який процес лежить в основі цього процесу? A. Зворотна транскрипція B. Зворотна трансляція C. Репресія оперону D. Конваріантна реплікація E. Дерепресія оперону 3. Для лікування урогенітальних інфекцій використовують хінолони – інгібітори ензима ДНК–гірази. Який процес порушується під дією хінолонів насамперед? А. Ампліфікація генів В. Реплікація С. Зворотна транскрипція D. Репарація E. Рекомбінація генів 4. В організм людини потрапили іони ртуті. Це призвело до збільшення частоти транскрипції гена, необхідного для детоксикації важких металів. Ампліфікація гена якого білка лежить в основі цього процесу? А. Металотіонеїну B. Церулоплазміну С. Інтерферону D. Трансферину E. Феритину 5. Молекулярний аналіз гемоглобіну пацієнта з анемією виявив заміну 6–Глу на 6–Вал у β–ланцюзі. Який молекулярний механізм патології? А. Генна мутація В. Хромосомна мутація С. Геномна мутація D. Ампліфікація генів Е. Трансдукція генів Індивідуальна самостійна робота студентів 1. Сучасні методи дослідження ДНК і РНК, їх клінічне значення. Література Основна:
Додаткова:
Змістовий модуль № 13. Основи молекулярної генетики. Тема № 4. Біосинтез білка у рибосомах. Дослідження процесів ініціації, елонгації та термінації в синтезі поліпептидного ланцюга. Інгібіторна дія антибіотиків. Засвоєння принципів генної інженерії та клонування генів, їх застосування в сучасній медицині. Мета заняття: Знати загальні закономірності синтезу білків, етапи цього процесу, можливі механізми виникнення та розвитку спадкових захворювань. Засвоїти механізм дії антибіотиків та інших інгібіторів синтезу білків. Знати принципи генної інженерії та клонування генів, їх застосування в сучасній медицині. Засвоїти принцип методу полімеразної ланцюгової реакції в експрес-діагностиці. Актуальність теми: Білки – це генетично детермінована система, яка генетично запрограмована специфічним набором для кожного індивідуума притаманних тільки йому білкових молекул і з якими пов’язана сутність життя. При вивченні даної теми акцентувати увагу на сучасних досягненнях генної інженерії, в тому числі клонуванні генів, що важливо для вивчення як нуклеотидної послідовності досліджуваного гена, так і послідовності мРНК і білка, які кодуються цим геном. Завдяки генній інженерії здійснено синтез інтерферону людини, людських інсуліну, соматотропіну, соматостатину, білкових препаратів для діагностики СНІДу тощо. Зокрема, в останні роки в діагностиці багатьох захворювань та виявленні бацилоносіїв використовують експрес-метод – полімеразну ланцюгову реакцію. Конкретні завдання:
Теоретичні питання
Практична робота Дослід № 1. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). ПЛР – це високоспецифічний метод експрес–діагностики, що дозволяє множити певні нуклеотидні послідовності до утворення необмеженого числа копій генів в таких кількостях, які можна виявити методом молекулярної гібридизації за допомогою електрофорезу. Принцип методу. ПЛР базується на багатократному повторюванні циклів синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК–мішені з дезоксинуклеозидтрифосфатів у присутності термостабільної ДНК–полімерази, відповідного сольового буфера та олігонуклеотидних затравок–праймерів, що визначають кордони ампліфікованої ділянки ДНК-мішені. Для діагностики інфекційного захворювання підбираються системи праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянкам генів, які дозволяють ампліфікувати фрагмент, що має для кожної системи праймерів свою довжину. Матеріальне забезпечення: 1) Обладнання: прилад ампліфікатор (забезпечує досліджуваним зразкам проходження необхідної кількості циклів, що включають: денатурацію ДНК при температурі 94±2˚С; відпалювання праймерів при температурі від 50 до 65˚С; синтез при температурі 72±2˚С; точність температурного режиму <0,5˚С; швидкість переходу температури >1,5˚С/с; тривалість циклів від 1 с до 4 хв та їх кількість – до 40); автоматичні мікропіпетки на 10 і 20 мкл з точністю до 0,5 мкл; пластикові пробірки на 0,2; 0,5 та 1,5 мл; одноразові наконечники до мікропіпеток; мікроцентрифуга; вортекс; апарат для електрофорезу ДНК в агарозному гелі; джерело постійного електричного струму (V – 50-250В, I – до 50мА); трансілюмінатор з фільтром на 310 нм; ламінарний бокс або бокс для ПЛР; фотоапарат з приставкою для реєстрації результатів ПЛР. 2) Реактиви: Для виділення ДНК з досліджуваних зразків застосовують фенольний або гуанідиновий методи. Використовують такі набори реагентів: 1. Набір для виділення ДНК із біопроб на 100 зразків (зберігають при +4˚С) : розчин І (лізуючий) 30мл, розчин ІІ (промивний) 10 мл, розчин ІІІ (промивний) 200 мл, сорбент 1000 мкл, ТЕ-буфер 5мл. 2. Набір для виділення ДНК/РНК із сироватки та плазми крові на 100 зразків (зберігають при +4˚С) : денатуруючий розчин – 45 мл, ізопропіловий спирт – 30 мл, промивний розчин – 100 мл, розчин носія – 300 мкл, вода дейонізована – 3 мл, хлороформ – 12 мл. 3. Набір для проведення ПЛР на 110 визначень (зберігати при температурі – 20˚С): реакційна суміш 300 мкл, Тад-полімераза (5 од/мкл) 25 мкл, вода дейонізована –2 мл, масло вазилінове – 2 мл, ДНК контрольна – 50 мкл. Реактив – термостабільну ДНК–полімеразу отримують із спеціального штама Bac. termophilis , сконструйованого методами генної інженерії. 4. Набір для приготування реакційної суміші, до складу якої входять: розчин ДНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфати), розчин специфічних праймерів, ПЛР-буфер, барвник. Основним реактивом тут є праймери– специфічні для кожного виду ділянки ДНК; їх отримують хімічним синтезом з відповідною послідовністю для даного виду, що складає 20-30 нуклеотидів. Праймери патентуються і строго зберігаються. Набори призначені для виявлення in vitro ДНК збудників інфекційних захворювань у біологічних зразках методом ПЛР з праймерами, специфічними до фрагментів геномів цього збудника і можуть бути використані для діагностики і контролю за специфічною терапією певної інфекції, а також бацилоносійства. Кожний набір розрахований на проведення аналізу 100 клінічних зразків при наявності ДНК збудників 10 зразків позитивного контрольного зразка та 10 зразків негативного (усього 120 визначень). Зберігання та експлуатація реактивів: 1. Комплекти для виділення ДНК та проведення електрофорезу повинні зберігатися при температурі 4-10˚С. 2. Комплект для проведення ПЛР повинен зберігатися при температурі – 18-25˚С. Хід роботи: Принципова схема полімеразної ланцюгової реакції представлена студентам у відеофільмі, який вони передивляються перед виконанням практичної роботи. Схема проведення ПЛР
На першій стадії при 94˚С проходить розділення ланцюгів ДНК (денатурація ДНК), на другій при 50–65˚С – приєднання (відпалювання) праймерів до гомологічних послідовностей на ДНК–мішені і на третій при температурі 72˚C – синтез нових ланцюгів ДНК, тобто комплементарна добудова ДНК шляхом подовження праймера у напрямку 5’–3’ з участю ДНК–полімерази в присутності іонів магнію. Таким чином, у першому циклі ампліфікації синтезуються продукти, які стають матрицями для другого циклу ампліфікації, в результаті якого, власне, і утворюється досліджуваний специфічний фрагмент ДНК – амплікон. Починаючи з третього циклу, амплікони стають матрицями для синтезу нових ланцюгів, тобто у кожному циклі здійснюється подвоєння кількості копій, що дозволяє за 25–40 циклів напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою відібраних праймерів, у кількості, якої достатньо для її детекції за допомогою електрофорезу;
Клініко-діагностичне та практичне значення. У медицині метод ПЛР застосовується для діагностики інфекцій шляхом ідентифікації патогенних бактерій і вірусів у біологічних рідинах та біоптатах тнанин людини. З метою діагностики кожної інфекції підбираються специфічні системи праймерів для ПЛР. За допомогою ПЛР одну молекулу ідентифікованої ДНК можна виявити в присутності міліонів інших молекул ДНК. При наявності відповідних наборів можна діагностувати декілька збудників захворювання в одній пробі. Чутливість реакції 97–99 %. ПЛР широко використовують у ранній діагностиці ВІЛ–інфекції, бацилоносійства, вірусних гепатитів тощо, а також для моніторинга і оцінки специфічної терапії певної інфекції, резистентності та чутливості до антибіотиків. Крім того метод ПЛР використовують для виявлення спадкових захворювань (фенілкетонурія, гемофілія та ін.), проведення „молекулярної дактилоскопії” у судовій практиці, встановлення батьківства, встановлення статі дитини на 10-му тижні вагітності, в онкології тощо. Контроль виконання лабораторної роботи 1. Обґрунтувати механізм дії антибіотиків – інгібіторів ініціації: стрептоміцину, ауринтрикарбоксилової кислоти, рифаміцину, рифампіцину. 2. Обґрунтувати механізм дії антибіотиків – інгібіторів елонгації: аміцетину, хлорамфеніколу, еритроміцину, циклогексиміду, пуроміцину, тетрациклінів. 3. Обґрунтувати механізм дії антибіотиків – інгібіторів термінації: анізоміцину, хлорамфеніколу, еритроміцину, лінкоцину, стрептоміцину. 4. У сучасних біохімічних дослідженнях для діагностики спадкових захворювань, виявлення присутності в організмі певних вірусів (в тому числі ВІЛ), ідентифікації особини (генна дактилоскопія у судовій медицині) використовується так звана “ДНК–діагностика”. Який метод використовується з цією метою? А. Електрофорезу В. Хроматографії С. Ланцюгової полімеразної реакції D. Рентгеноструктурного аналізу E. Електронної мікроскопії 5. Тетрацикліни – це антибіотики широкого спектру дії, які є інгібіторами синтезу білків на 70 S рибосомах прокаріот, не впливаючи при цьому на 80 S рибосоми еукаріот. Рибосоми мітохондрій еукаріот за структурою подібні до рибосом прокаріот (70 S). Використовуючи ці дані, поясніть токсичний ефект тетрациклінів. 6. Після тривалої, виснажливої хвороби і операційного втручання у пацієнта спостерігається різка втрата маси тіла і затримка процесу одужування. Лікар призначив йому анаболічний препарат. Який біохімічний процес стимулюють такі препарати? 7. Що розуміють під поняттям ”клінічний зразок” для ПЛР? 8. Які методи використовують для виділення ДНК? 9. На чому грунтується полімеразна ланцюгова реакція? 10. Назвіть склад реакційної суміші для проведення ПЛР. 11. Охарактеризуйте три стадії циклу синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК–мішені. 12. З якою метою при проведенні ПЛР використовують затравку– праймер? 13. На чому ґрунтується підбір системи праймерів для діагностики кожної інфекції? 14. Яким методом розділюють продукти ампліфікації? 15. На чому ґрунтується аналіз результатів ПЛР? 16. Яке клініко-діагностичне та практичне значення ПЛР як методу експрес-діагностики? Приклади тестів „Крок–1” 1. При захворюванні на дифтерію спостерігається інгібування процесу трансляції у клітинах людини за рахунок втрати фактором елонгації еEF-2 властивості здійснювати транслокацію пептидного залишку з А- на П-сайт рибосом. Який фермент є причиною блокування еEF-2? A. АДФ-рибозилтрансфераза B. еIF-2-Протеїнкіназа C. Пептидилтрансфераза D. Пептидилтранслоказа E. Гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансфераза 2. Для лікування інфекційних бактеріальних захворювань використовують антибіотики (стрептоміцин, неоміцин, канаміцин). Який етап синтезу білків мікробної клітини вони інгібують? A. Реплікацію B. Транскрипцію C. Трансляцію D. Процесинг E. Сплайсинг 3. За допомогою якого ферменту здійснюється шлях синтезу різних генів з матричних РНК та ДНК в генній інженерії (цей фермент каталізує процес, відкритий у деяких РНК–вмісних вірусів)? А. Ревертази В. Екзонуклеази С. Ендонуклеази D. ДНК–лігази Е. Хелікази 4. Пацієнтові, що проживає на специфічній геохімічній території, встановлено діагноз – ендемічний зоб. Який вид посттрансляційної модифікації тиреоглобуліну порушений в організмі хворого? А. Фосфорилювання В. Метилювання С. Ацетилювання D. Йодування Е. Глікозилювання 5. Спадкова інформація зберігається в ДНК, хоч безпосередньо у синтезі білка в клітині вона не бере участі. Який процес забезпечує реалізацію спадкової інформації у поліпептидний ланцюг? А. Транскрипція В. Трансляція С. Транслокація D. Реплікація Е. Трансформація Тема самостійної індивідуальної роботи для студентів 1. Характеристика процесів транскрипції в нормі та при патології. Програмована загибель клітини. Апоптоз та його біохімічні механізми. 2. Генна інженерія. Клонування. Застосування методів генної інженерії у сучасній медицині. Література Основна:
Додаткова:
|