Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ДЛЯ СТУДЕНТОВ
ПО ИЗУЧЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ
«ИММУНОЛОГИЯ»
Модуль II «Клиническая иммунология»
Оренбург, 2015
1
Практическое занятие № 1.
Тема: Механизмы врожденного иммунитета. Цитокины.
Цель: Изучить основные факторы врожденного иммунитета и регуляторные механизмы неспецифической защиты организма от патогенов и продуктов повреждения собственных клеток Задачи:
Изучить роль факторов врожденного иммунитета человека в защите от патогенов и продуктов повреждения собственных тканей.
Выяснить основные механизмы формирования и реализации клеточных и гуморальных механизмов врожденного иммунитета.
Вопросы для рассмотрения:
Клеточные эффекторы врожденного иммунитета (нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, естественные киллеры, эозинофилы, базофилы, тучные клетки).
Гуморальные эффекторы врожденного иммунитета (система комплемента, реактанты острой фазы, белки теплового шока, цитокины). Альтернативный и классический пути активации комплемента.
Бактерицидные продукты нейтрофилов и макрофагов (кислородзависимые, кислороднезависимые).
Патогенаассоциированные молекулярные паттерны (образы патогенности, РАМР); свойства, структура, виды, роль во врожденном иммунитете.
Рецепторы врожденного иммунитета. Распознавание (опосредованное, прямое) патогенов клетками врожденного иммунитета (растворимые рецепторы, мембранные рецепторы, цитоплазматические рецепторы).
Строение Toll-подобных рецепторов, лиганды, экспрессия клетками иммунной системы. NOD-рецепторы (сайты связывания, функция).
Пути передачи и последствия передачи сигналов с рецепторов врожденного иммунитета.
Цитокины: классификация, свойства (избыточность, каскадность, плейотропность, синергизм, антагонизм). Система цитокинов (клетки-продуценты, клетки-мишени с рецепторами для цитокинов, растворимые цитокины, растворимые рецепторы, антагонисты рецепторов, антагонисты цитокинов).
Типы цитокиновой регуляции клеток-мишеней (аутокринный, паракринный, эндокринный механизмы).
Методы оценки системы цитокинов.
Основные понятия темы:
Назначение врожденного (естественного) иммунитета:
первичное распознавание клетками миеломоноцитарного ряда существенных сходных структурных компонентов различных патогенов - РАМР (pathogen-associated molecular patterns ), отсутствующих у человека и эндогенных измененных молекул (DAMP)
уничтожение и удаление из организма патогенов и измененных эндогенных молекул (DAMP)
Механизмы распознавания «своего» и «чужого» на начальных этапах врожденного иммунитета включают клетки, распознающие патогены и их компоненты. Этими клетками являются клетки миеломоноцитарного ряда, распознаваемые ими структуры - сходные консервативные структурные компоненты (или образцы -«паттерны») у патогенов - РАМР. Распознавание РАМР осуществляется с помощью
2
Работа 1
Цель: Изучить особенности клеток, реализующих механизмы врожденного иммунитета. Задача: Заполнить правую часть предлагаемой таблицы.
паттернраспознающих рецепторов (PRR) - молекулярных структур распознавания различных типов микроорганизмов. Примерами РАМР-ов являются ЛПС, пептидогликаны, белок флагеллин и др.
Среди паттернраспознающих рецепторов выделяют три основные группы: растворимые (белки системы комплемента и др ), мембранные ( Toll -рецепторы, CD-14 и др..) и внутриклеточные( NOD-, RIG-like-рецепторы).
Клеточными эффекторами врожденного иммунитета являются:
фагоцитирующие клетки (нейтрофилы, моноциты, макрофаги); клетки, выделяющие медиаторы воспаления (базофилы, тучные клетки, эозинофилы); натуральные киллеры (NK-клетки). Типы рецепторов NK-клеток: ингибирующие; рецепторы, реагирующие с молекулами МНС- I: KIR-рецепторы; лектиноподобные; иммуноглобулиноподобные
лейкоцитарные транскрипты ( ILT-2); рецепторы, активирующие семейство
иммуноглобулин- и лектинподобных рецепторов.
К гуморальным факторам врожденного иммунитета относят: белки
комплемента, белки острой фазы, цитокины. К эффекторным молекулам врожденного иммунитета относят атимикробные пептиды: дефенсины беспозвоночных, Р-дефенсины, а-дефенсины, 0-дефенсины, кателицидины (LL-37, протегрины, профенины); белки: лизоцим, фосфолипаза А2, сериновые протеиназы (эластаза, катепсин G), бактерицидный проницаемость увеличивающий белок, лактоферрин, пероксидазы (миелопероксидаза, эозинофильная пероксидаза, лактопероксидаза); активные формы кислорода и азота: 02-, Н202, ОН, ОС1-, N0.
В регуляции механизмов иммунитета активное участие принимают цитокины - медиаторы межклеточного взаимодействия. Цитокины - физиологически активные полипептиды с молекулярной массой 15-60 кД. Цитокины продуцируются активированными клетками иммунной системы (лимфоциты, моноциты) и активированными клетками других типов (эпителиоциты, клетки эндотелия и др.). С их помощью осуществляется аутокринная и паракринная регуляция механизмов врожденного иммунитета. Аутокринная регуляция осуществляется за счет короткодистантного действия медиаторов (цитокинов) на сами клетки-продуценты. При паракринной регуляции действие цитокинов направлено на другие клетки-мишени (длиннодистантные сигнальные механизмы). Наличие специфических рецепторов на поверхности клеток-мишеней является необходимым условием для реализации эффектов цитокинов. Характерная особенность цитокинов - способность действовать каскадно, системно: если одна клетка начинает выработку цитокинов, тем самым она индуцирует продукцию цитокинов в других клетках. Каждый тип иммунокомпетентных клеток способен вырабатывать несколько цитокинов, с другой стороны, каждый вид цитокинов может продуцироваться разными типами клеток. Важным свойством цитокинов является их полифункциональность с перекрытием разных эффектов. В процессе взаимодействия цитокинов проявляется как синергизм, так и антагонизм в зависимости от конкретной ситуации, в частности, это может привести к доминированию клеточной либо гуморальной формы защитных реакций.
САМОСТОЯТЕЛЬНЫЕ ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Название
|
Характеристика
|
Макрофаги
|
|
Моноциты
|
|
Нейтрофилы
|
|
3
Измерьте диаметр зоны лизиса микрококка на чашке для определения лизоцима. Используя данные таблицы, пересчитайте количество лизоцима.
Работа 2
Цель: Ознакомиться с методами определения гуморальных показателей
естественной резистентности: лизоцима и бактерицидной активности сыворотки.
Задача. Обследуемый А, 18 лет, с 7 лет находящийся на диспансерном учете в
группе ЧБД («часто болеющие дети»), был направлен в клинико-иммунологическую
лабораторию для оценки состояния факторов естественной резистентности (обследование
проведено в весеннее время). Определите уровень лизоцима и бактерицидной активности
сыворотки (БАС). Сравните полученные данные с нормативными значениями, оцените
результат и сделайте заключение о состоянии естественной резистентности обследуемого
А.
Методика:
Определение количества лизоцима в сыворотке методом диффузии в агаре.
Микробную взвесь тест-культуры ацетонированного микрококка (M.lysodeicticus) вносят
в расплавленный и охлажденный до 45°С агар. На 60 мл агара берут 40 мл (сухой вес)
бактерий, суспензированных в 4 мл солевого раствора. Агар разливают в чашки Петри и
после застывания делают в агаре лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку крови.
В контрольные лунки вносят стандартный лизоцим куриного белка в концентрации от 0,5
до 8 мкг/мл. Чашки инкубируют в течение суток при 37°С.
Учет результатов проводят путем замера зон лизиса микрококка вокруг лунок с
внесенными образцами проб сывороток. Количество лизоцима расчитывают по
специальной таблице, построенной на основании литического действия различных
концентраций стандартного лизоцима в отношении тест-культур микрококка.
Эозинофилы
|
|
Естественные
киллеры
|
|
Дендритные
клетки
|
|
Базофилы
|
|
Тучные клетки
|
|
Лизоцим
|
Диаметр зоны лизиса микрококка (см)
|
Содержание лизоцима (мкг/мл)
|
0,4
|
4,9
|
0,5
|
5,0
|
0,6
|
5,4
|
0,7
|
5,9
|
0,8
|
6,5
|
0,9
|
7,2
|
1,0
|
7,9
|
2. Определение бактерицидной активности сыворотки (БАС)
Исследование основано на классическом методе Бюхнера, позволяющем судить о
бактерицидной активности сыворотки по количеству колоний тест-культуры, выросшей
при высеве до и после инкубации с исследуемой сывороткой. К исследуемой сыворотке в
объеме 1 мл добавляют 0,1 мл 1 млрд взвеси суточной культуры кишечной палочки. Затем
делают два посева на чашки Петри с питательной средой. Один посев - сразу же после
смешивания культуры с сывороткой (контроль), а второй - после инкубации 30 мин при
37°С (опыт). Посевы инкубируют сутки в термостате и затем подсчитывают число
выросших колоний в опытной и контрольной чашках.
4
1983.
Вывод: (ответить на вопросы: 1. По каким показателям выявлены изменения в состоянии естественной резистентности? 2. Сделайте заключение о состоянии естественной резистентности у обследуемого? Что может быть причиной этих изменений
Работа 3
Цель: Определить роль паттерниндуцированных феноменов в защитных реакциях организма.
Задача: заполнить правую часть предлагаемой таблицы.
* Нормативные значения даны из методических рекомендаций «Региональные нормы показателей естественного иммунитета населения Южного Урала». Оренбург,
ПРОТОКОЛ:
По формуле определяют БАС:
100%,
А
где А1 - число колоний в опытной чашке,
А - число колоний в контрольной чашке (рис.3.7.).
Подсчитайте количество колоний кишечной палочки в опытной и контрольной чашках для определения БАС, по формуле определите уровень БАС в процентах. Все данные внесите в протокол, сравните с нормативными значениями.
ФИО
|
БАС
|
Лизоцим
|
Количество колоний в контрольной чашке
|
Количество колоний в опытной чашке
|
БАС (%)
|
Диаметр
зоны
лизиса
микрококка
(см)
|
Количество лизоцима (мкг/ мл)
|
Нормативные значения* (пол- мужской, возраст - 18 лет, сезон обследования - весна)
|
|
|
80,6
|
|
6,8
|
Обследуемый А.
|
|
|
|
|
|
Феномен
|
Роль в защитных реакциях организма человека
|
Индукция синтеза прововоспалительных цитокинов
|
|
Индукция синтеза интерферонов I типа
|
|
Индукция синтеза хемокинов
|
|
Активация NO-синтазы
|
|
Синтез свободных форм кислорода
|
|
Индукция дифференцировки дендритных клеток
|
|
Активация комплемента
|
|
ПИСЬМЕННОЕ ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ Задание 1. Разобрать механизмы системного действия IL-1. Заполнить графу (биологическое действие) в предлагаемой таблице.
5
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ОТВЕТЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ ВО ВНЕУЧЕБНОЕ ВРЕМЯ
Органы и ткани
|
Клетки-мишени
|
Биологическое действие
|
Эндокринная
система
|
Клетки коры надпочечников
|
|
Клетки щитовидной железы
|
|
Иммунная
система
|
Нейтрофильные
гранулоциты
|
|
Базовые и тучные клетки
|
|
Дендритные клетки
|
|
Моноциты/Макрофаги
|
|
Т-лимфоциты
|
|
В-лимфоциты
|
|
NK-клетки
|
|
Система
кроветворения
|
Костномозговые
предшественники
гемопоэза
|
|
Периферическая
кровь
|
Лейкоциты
|
|
1 .Клетки, распознающие патогены врожденным иммунитетом
|
Клетки миеломоноцитарного ряда
|
2.Структуры, распознаваемые механизмами врожденного иммунитета
|
Паттерны или пампы (РАМР)
|
3. Примеры паттернов
|
ЛПС, пептидогликан, ДНК,РНК вирусов, липоарабиноманан, флагеллин
|
4.Виды паттернраспознающих рецепторов
|
Растворимые, цитоплазматические, мембранные
|
5.Цитокины системного действия
|
ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа
|
6.Цитокины антагонисты
|
ИЛ-4 и ИФНу
|
7.Провоспалительные цитокины
|
ИЛ-1.ИЛ-6, ФНОа, ИФНу
|
8.Противовоспалительные цитокины
|
ИЛ-10, ТФРр
|
Факторы естественной резистентности (ФЕР)
|
Нормальная микрофлора
Клеточные
Еуморальные
|
Клеточные факторы естественной резистентности
|
Бактерицидность кожи и слизистых
Барьер-фиксирующая способность лимфатических узлов, клеток РЭС
Фагоцитоз
Клеточная ареактивность
Воспаление
Естественные киллеры или Natural killer (ЕК - или NK-клетки)
|
Классификация клеток, участвующих в реакциях фагоцитоза
|
Система мононуклеарных фагоцитов (СМФ)
Система полиморфноядерных фагоцитов
|
Основные стадии фагоцитоза
|
Хемотаксис
Адгезия
Эндоцитоз
|
6
|
Образование фагосомы
Образование фаголизосомы
Внутриклеточное переваривание
|
Незавершенный фагоцитоз
|
Микробы в фагоците не перевариваются, а сохраняются и могут размножаться
|
Завершенный фагоцитоз
|
Полное внутриклеточное переваривание микробов, приводящее к их исчезновению
|
Механизмы завершенного фагоцитоза
|
Кислородзависимые
Кислороднезависимые
|
Кислородзависимые механизмы (факторы)
|
Кислородные радикалы, перекиси, оксид азота и др.
|
Кислороднезависимые механизмы (факторы)
|
Лактоферрин, лизоцим, дефенсины, фосфатазы, протеазы и др.
|
Дефенсины
|
Катионные лизосомальные пептиды антимикробного действия
|
Лактоферрин
|
Еликопротеин, связывающий ионы железа, меди, цинка на поверхностных структурах микроорганизмов
|
Механизм бактериостатического и бактерицидного действия лактоферрина
|
Создает дефицит жизненно важных для микроорганизмов микроэлементов, входящих в состав цитохромов дыхательной цепи, каталаз, пероксидаз, супероксиддисмутаз
Способствует продукции ОН' (гидроксильных) радикалов из молекулярного кислорода и пероксида водорода
|
Лизоцим (мурамидаза)
|
Фермент, лизирующий гликановый компонент пептидогликанового комплекса клеточной стенки бактерий
|
Наиболее чувствительные к лизоциму микроорганизмы
|
Грамположительные бактерии
|
Естественные или нулевые киллеры (ЕК или NK)
|
Большие гранулосодержащиен лимфоциты, обладающие цитотоксическим действием против раковых клеток, простейших и клеток, инфицированных вирусом
|
Г ум оральные факторы естественной резистентности
|
Система комплемента
Лизоцим
Бета-лизины
Пропердин
Лейкины и другие вещества, обусловливающие бактерицидную активность сыворотки крови (БАС)
Белки острой фазы (БОФ)
|
Система комплемента
|
Система плазменных белковых веществ, последовательная активация которых приводит к их литическому действию на клеточные мембраны
|
Пути активации комплемента
|
Классический
Альтернативный
|
Классический путь активации комплемента
|
Участие антител и «ранних» компонентов комплемента (С1, С2, С4) в образовании мембраноатакующего комплекса
|
Альтернативный путь активации комплемента
|
Мембраноатакующий комплекс формируется без участия антител, С 1, С2 и С4 компонентов.
|
7
|
Участвуют компонент СЗ и компоненты: С5, С6, С7, С8, С9
|
Функции комплемента
|
Лизис бактерий и чужеродных клеток
Стимуляция фагоцитоза
Стимуляция хемотаксиса
Участие в воспалении
Участие в индукции иммунного ответа
Нейтрализация вирусов
Участие в анафилаксии
|
Мишень и результат действия комплемента
|
Клеточная мембрана, ее лизис
|
Биологическая роль лизоцима как фактора естественной резистентности
|
Антимикробный эффект
Регуляция иммунитета (активация комплемента, фагоцитоза, антителообразования)
Участие в процессах пролиферации клеток
Противовоспалительное действие
|
Бета-лизины
(тромбоцитарные катионные белки)
|
Сывороточные белки тромбоцитарного происхождения, повреждающие цитоплазматическую мембрану бактерий
|
Опсонины
|
Сывороточные факторы, способствующие фагоцитозу микроорганизмов
|
Виды опсонинов
|
Антитела (IgG), компоненты комплемента (особенно СЗЬ), белки острой фазы
|
Механизм опсонизации
|
Связывание опсонинов с компонентами клеточной стенки микроорганизмов (благодаря химическому родству между ними) и последующий фагоцитоз образовавшегося комплекса (благодаря наличию рецепторов для опсонинов на фагоцитах)
|
Пропердин
|
Белок, участвует в активации комплемента
|
Белки острой фазы (БОФ)
|
С - реактивный белок, сывороточные амилоиды А и Р, трансферрин и др.
|
Функции БОФ
|
Антимикробное действие
Активация фагоцитоза
Активация комплемента
Формирование и ликвидация очага воспаления
Связывание железа - подавление метаболизма патогена
|
Практическое занятие №2.
-
|
Скачать 0.6 Mb.
