Фотометрия. Абсорбционные методы. Фотометрия

Скачать 1.51 Mb.

Название	Абсорбционные методы. Фотометрия
Анкор	Фотометрия.docx
Дата	22.04.2017
Размер	1.51 Mb.
Формат файла
Имя файла	Фотометрия.docx
Тип	Документы #1495
страница	1 из 8

1 2 3 4 5 6 7 8

АБСОРБЦИОННЫЕ МЕТОДЫ. ФОТОМЕТРИЯ

Рассматриваемые методы относятся к физическим (УФ- и ИК-спектрофотометрия) или к физико-химическим (фотоэлектроколориметрия). Они широко используются как для установления структуры новых биологически активных веществ, так и на различных стадиях контроля качества лекарственных средств.

1.2.1 Общие теоретические положения.

Электромагнитный спектр и его характеристика

Электромагнитное излучение имеет двойственную природу: волновую и корпускулярную. Скорость распространения Электромагнитных волн в вакууме является константой, численное значение которой составляет 3·10¹⁰ см/сек. Хотя эта величина и является постоянной, частота и длина волны излучения могут быть переменными. Между этими величинами существует зависимость, выражаемая уравнением:

С = λ · ν (1), где

С – скорость света в вакууме;

ν – частота колебаний, имеет размерность С^-1 или Гц (герц);

λ – длина волны излучения, выражаемая в долях метра: см, мкм (10^-6), нм (10^-9 м) и ангстремах (Å = 10^-10 м);

В УФ- и видимой областях длину волны обычно выражают в нм (нанометрах), в ИК-области – мкм (микрометрах) или волновых числах, ν’.

Волновое число – это число волн, приходящееся на 1 см длины светового луча, оно прямо пропорционально частоте, а, значит, и энергии квантов:

ν’ =

· ν (2)

ν’ имеет размерность см^-1 (обратные сантиметры).

Из уравнения (1) следует, что существует обратно пропорциональная зависимость между частотой и длиной волны.

Испускание и поглощение электромагнитного излучения происходит квантами, энергия которых описывается уравнением:

ΔЕ = h · ν = h ·

(3), где

h – постоянная Планка (6,5 · 10^-27 эрг/сек).

Из уравнения (3) следует, что энергия кванта пропорциональна частоте колебаний и обратно пропорциональна длине волны.

Электромагнитные волны охватывают гораздо больший диапазон длин волн, чем воспринимает человеческий глаз. Длины волн измеряются от километров для радиоволн до величины порядка 10^-8 см для рентгеновских лучей, но не следует думать, что даже эти величины являются верхней и нижней границами: γ-лучи имеют еще более короткие волны, чем рентгеновские, тогда как на другом конце спектра радиоволны постепенно приобретают характер переменных электрических токов.

Основные области электромагнитного спектра, расположенные в порядке уменьшения энергии (увеличения λ) представлены в табл. 1.

Из таблицы 1 и уравнения (2) следует, что с уменьшением λ увеличивается Е электромагнитного излучения, что определяет характер взаимодействия электромагнитных волн с исследуемым веществом.

Использование указанного в таблице интервала спектра в аналитических целях обусловлено тем, что излучение в каждой из областей обладает энергией, соизмеримой с энергией связей химических соединений. Более коротковолновое излучение может приводить к разрушению связей в молекулах, а более длинноволновое слабо взаимодействует на химические связи и поэтому не дает информации о строении молекулы.

Каждый из интересующих нас процессов возбуждения молекул квантован, то есть возбужденное состояние отделено от основного состояния дискретными, определенными количествами энергии. Поэтому молекула не может поглотить все «типы» частот спектра электромагнитного излучения, она может поглощать только те частоты, которые соответствуют энергии (ΔЕ), требующейся для ее возбуждения при переходе с одного на другой, более высокий энергетический уровень. Это, в свою очередь, позволяет нам отнести определенные частоты поглощения к определенным типам переходов.

Каждая основная область электромагнитного спектра связана, по крайней мере, с одним типом переходов. Например, поглощение в видимой и ультрафиолетовой областях приводит к переходам электронов из основного электронного состояния в возбужденное электронное состояние, а поглощение инфракрасного излучения определенной частоты вынуждает связанные атомы колебаться относительно их средних положений.

Как происходят взаимодействие вещества с электромагнитным излучением? В соответствии с квантово-механическими представлениями электроны в молекулах органических соединений могут располагаться на связывающих, несвязывающих и разрыхляющих орбиталях. На связывающих орбиталях располагаются электроны, участвующие в образовании валентных связей – σ, π-электроны. σ-электроны участвуют в образовании простых (одинарных связей) π-кратных (двойных и тройных). На несвязывающих орбиталях располагаются электроны, не участвующие в образовании химических связей – это n-электроны; ими являются свободные электроны пары гетероатомов – O, N, Hal. Расположение электронов на связывающих и несвязывающих орбиталях соответствует основному состоянию молекулы. Нахождение электронов на разрыхляющих – возбужденному, которое возникает при поглощении молекулой определенного количества энергии. При возбуждении возможен переход электронов с одних орбиталей на другие, что можно выразить схемой, представленной на рис. 1.

.

Рис. 1. Схема энергетических электронных уровней и возможных электронных переходов
С точки зрения квантовой механики разрешенными являются следующие переходы:

σ → σ* n → σ*π → π*n → π*

Различные электронные переходы требуют неодинаковой энергии, поэтому полосы в спектре поглощения располагаются при разных длинах волн. Наибольшей энергии требуют σ → σ* переход, связанный с возбуждением внутренних электронов σ- связи. Он соответствует поглощению в далекой УФ-области, такие переходы наблюдаются в насыщенных соединениях – алканах (область 160-180 нм).

Переход n → σ* связан уже с меньшими затратами энергии, полосы поглощения располагаются в области 200-300 нм. Еще меньшая энергия требуется для перехода на разрыхляющих π* - орбиталь; переходы n → π* и π → π* встречаются в молекулах соединений с сопряженными связями, в том числе в молекулах ароматических соединений.

Таким образом, в общем случае энергия разрешенных правилами отбора электронных переходов системы возрастает в последовательности:

n → π* < π → π* < n → σ* < σ → σ*

Следовательно, существенными элементами, обуславливающими наличие электронных спектров органических молекул, является кратная связь и неподеленная электронная пара. Их наличие, многочисленные сочетания в молекулах с разнообразными заместителями объясняют совокупность электронных спектров органических соединений. Группировки, содержащие в своем составе сопряженные двойные связи и неподеленные пары электронов, называются хромофорами.

Электронные переходы, вызванные поглощением определенных квантов световой энергии, характеризуются наличием определенных полос поглощения в электронных спектрах атомов или молекул.

Природа полос поглощения в УФ (200-400 нм) и видимой (400-800 нм) областях спектра одинакова и связана, главным образом, с числом и расположением электронов в поглощающих молекулах и ионах. Вещества, поглощающие только в УФ-области, для человеческого глаза являются бесцветными.

Путем изучения модельных соединений были определены длины волн УФ- и видимого света, поглощаемые тем или иными структурными элементами (хромофорами). Ориентировочные значения максимумов поглощения некоторых хромофоров приведены в табл. 2.

На положение максимума поглощения хромофоров влияют и другие группы, усиливающие светопоглощение хромофорами. Такие группы называются ауксохромами. Они могут быть электродонорными (-ОН, -NН₂, - ОСН₃, -NHCH₃, -N(СН₃)₂) и электроноакцепторными (-SO₂NH₂, -COOH, -NO₂, простая и сложноэфирная группы).

При облучении исследуемого вещества электромагнитным излучением с постепенно изменяющейся λ (или энергией) можно проследить изменение интенсивности его поглощения. Графическое изображение этой зависимости – называется спектром. Он может быть построен как график зависимости оптической плотности (D), коэффициента поглощения (или его логарифма) от длины волны света, падающего на исследуемый образец. Область интенсивного поглощения в нем называется полосой, максимумом поглощения. Длина волны, при которой наблюдается максимум, обозначается λ_max, ее называют также аналитической длиной волны. В спектрах может наблюдаться от одного до нескольких максимумов, соответствующих различным типам электронных переходов.

Поглощение называют характеристическим, если оно вызывается определенной группой атомов, причем характер поглощения относительно мало изменяется с изменением остальной части молекулы.

Наличие в спектрах характеристических полос поглощения позволяет обнаружить в веществе определенные структурные элементы и, таким образом, сделать вывод о строении органического соединения.

Вид спектральной кривой зависит от растворителя, от наличия в молекуле исследуемого вещества тех или иных заместителей, от поведения вещества в растворе (в частности, от способности образовывать внутри- и межмолекулярные водородные связи, от наличия или отсутствия динамической изомерии и т.д.).

Все эти факторы могут вызвать сдвиг λ_max и изменение интенсивности поглощения. Для характеристики подобных изменений применяют специальные термины.

Если полоса поглощения смещается в сторону более длинных волн, говорят о батохромном смещении или углублении окраски (красное смещение), а если полоса поглощения сдвигается в сторону более коротких волн, эффект называется гипсохромным или повышением окраски (голубое или синее смещение).

Таблица 2

Максимумы поглощения некоторых хромофоров

и соответствующие им типы электронных переходов

Хромофор	λ_max_, нм	Тип перехода
>с = о карбонил	280	n → π*
	204	n → π*
	220	π → π*
-N0₂ нитросоединения	280	n → π*
- N = N - азогруппа	370	n → π*
	290	n → π*
	210	n → π*
	260	π → π*
	275	π → π*
	370	π → π*
	460	π → π

Для характеристики изменения интенсивности поглощения применяют понятия: гиперхромный эффект (усиление интенсивности), гипохромный (ослабление интенсивности).

Описанные эффекты графически представлены на рис. 2, а конкретное их проявление в спектрах лекарственных веществ приведено на рис. 9 – 14.

Рис. 2. Эффекты изменения максимума и интенсивности поглощения:

А - гипсохромный эффект; 2 - батохромный эффек

Б 1 - гиперхромный эффект; 2 - гипохромный эффект.
1.2.2 Основной закон светопоглощения

При прохождении света через раствор исследуемого вещества часть его отражается, часть поглощается, часть рассеивается, и часть проходит через вещество.

Электромагнитное излучение характеризуется понятием интенсивность (I). Интенсивность падающего светового потока (I₀) при прохождении через исследуемый раствор разлагается на составляющие (рис. 3).

При работе с истинными растворами пренебрегают (I_рас), а при использовании одинаковых кювет пренебрегают (I_отр), тогда I₀ = I_a + I.

Интенсивность поглощения характеризуется величиной оптической плотности (D), которую называют экстинкцией, погашением. В ряде руководств оптическую плотность обозначают через А. Она представляет собой десятичный логарифм отношения интенсивности светового потока, падающего на вещество (I₀) к интенсивности светового потока, прошедшего через вещество (I):

lg

= D (4)

Рис. 3 Прохождение светового потока через исследуемый раствор

I₀ = I_отр + I_рас + I_а + I (3), где

I_отр – интенсивность отраженного света;

I_рас – интенсивность рассеянного света;

I_а – интенсивность света, поглощенного веществом;

I – интенсивность света, прошедшего через вещество.

Зависимость поглощения от толщины слоя исследуемого вещества определяется законом Бугера-Ламберта:

D = lg

= K · в (5), где

в – толщина слоя, см;

К – показатель поглощения.

Зависимость концентрации исследуемого вещества и поглощения определяется законом Бера:

К = χ · С (6), где

С – концентрация исследуемого вещества в процентах (%) или г/молях;

χ – показатель поглощения раствора, концентрация которого равна 1.

В основе фотометрических методов лежит объединенный закон светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера, который отражает прямо пропорциональную зависимость оптической плотности от концентрации и толщины определяемого слоя:

D = lg

= C · в · χ (7)

Величина показателя поглощения (χ) является специфической физической константой для каждого вещества и зависит от его природы.

Показатель поглощения в формуле (6) может иметь два значения: молярного (ε) и (или) удельного показателя поглощения (Е

).

Молярный показатель поглощения (ε) представляет собой оптическую плотность одномолярного раствора при толщине слоя 1 см.

Удельный показатель поглощения (Е

) – это оптическая плотность раствора, содержащего 1,0 вещества в 100 мл раствора при толщине слоя 1 см.

Связь удельного и молярного показателей поглощения определяется отношением:

ε = Е

(8)

Характеристика методов, основанных на поглощении электромагнитного излучения

Методы, основанные на поглощении электромагнитного излучения, подразделяются в зависимости от используемого диапазона длин волн:

- УФ-спектрофотометрия (200-400 нм);

- Фотометрия в видимой области спектра (400-800 нм);

- ИК-спектрофотометрия (2-15 мкм; 4000-400 см^-1).

В зависимости от способов фиксирования поглощения и от используемой аппаратуры они подразделяются на визуальные (колориметрия) и фотоэлектрические (фотоколориметрия и спектрофотометрия). В зависимости от типа излучения, падающего на исследуемое вещество (фотоколориметрия и спектрофотометрия).

Фотоколориметрический метод основан на поглощении веществлом немонохроматического (в диапазоне определенного интервала длин волн) света, получаемого при пропускании светового потока через светофильтры.

Спектрофотометрический метод основан на поглощении веществом монохроматического (определенной длины волны) света, получаемого при пропускании светового потока через монохроматор.

1.2.3 Фотометрия в видимой области спектра

1.2.3.1 Колориметрия

При колориметрических способах интенсивность окраски исследуемого раствора визуально сравнивают с интенсивностью окраски стандартных растворов, используя при этом несложное аппаратурное оформление: колориметрические пробирки, цилиндры, колориметры.

Варианты колориметрического метода

1. Метод уравнения: окрашенную пробу и стандартный раствор разбавляют в сосудах одинакового диаметра соответствующим растворителем до совпадения окрасок.

2. Колориметрическое титрование: уравнивают окраску исследуемого окрашенного раствора с окраской раствора, содержащего все вещества, за исключением анализируемого. Затем во второй раствор постепенно до получения эффекта сравнения окрасок добавляют стандартный раствор анализируемого вещества.

3. Метод стандартных серий: окрашенную пробу сравнивают со шкалой стандартных растворов, содержащих исследуемые вещества в определенных концентрациях, подбирая совпадение окрасок.

По данному способу по ГФ ΧΙ издания определяется рН растворов, допустимые примеси (соли аммония, железа и мышьяка) и окраска жидкостей с помощью эталонных растворов (табл. 3).

1 2 3 4 5 6 7 8