- 1 практическая работа. Строение генетических структур клетки. Изучение поведения хромосом в процессе клеточных делении. Задание .
- Материал и оборудование.
- 2 практическая работа. Знакомство с материалами и оборудованием цитогенетического практикума. Задание.
- 3 практическая работа. Составление картограмм. Вычисление и анализ линейных параметров хромосом.
- Материал и оборудование. 1.
- Знакомство с биологией и морфологией дрозофилы. Постановка опытов по скрещиванию дрозофил, различающихся по изучаемым признакам.
- Инвентарь и оборудование, необходимые при работе с дрозофилой.
- Питательные среды и их приготовление.
генетика практика. Цитологические основы генетики
 Скачать 4.75 Mb.
|
|
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ГЕНЕТИКИ Генетика изучает наследственность и изменчивость организмов. Клетка — основа строения и жизнедеятельности всех животных и растений, поэтому все явления наследственности и изменчивости могут быть поняты только на основе изучения строения клетки и ее функций. Раздел генетики, который изучает явления наследственности и изменчивости на основе цитологических методов, получил название цитогенетики. Объектом цитогенетических исследований является клетка и в особенности хромосомы, их морфология, биохимия и физиология. Изучение клетки ведется преимущественно с помощью светового микроскопа. Для изучения морфологии клетки, помимо обычной световой микроскопии, применяют поляризационную, фазово-контрастную, люминесцентную, ультрафиолетовую микроскопию, что позволяет изучать клетку в живом состоянии, а также определять химический состав клетки в целом и отдельных ее органелл. В последние годы для изучения клетки широко используют электронные микроскопы, позволяющие рассматривать органеллы клетки размером 8—10 А (1 ангстрем равен 0,0000001 мм). Это дает возможность рассматривать предельно мелкие клеточные структуры и даже отдельные молекулы. №1 практическая работа. Строение генетических структур клетки. Изучение поведения хромосом в процессе клеточных делении. Задание. Внимательно рассмотреть клетки, находящиеся в интерфазе, профазе, метафазе, анафазе и телофазе, и зарисовать их. Особое внимание обратить на хромосомы. Материал и оборудование. 1. Препарат с продольными срезами корешков лука или любого другого растения, 2. Микроскоп. 3. Рисовальный аппарат. Пояснения к заданию. Митоз (кариокинез) — сложный тип деления, протекающий в соматических клетках и являющийся основным способом их размножения. Совокупность процессов, происходящих в клетке между двумя делениями, называется митотическим циклом. В процессе митоза происходит сначала удвоение, а затем точное равномерное распределение наследственного материала, содержащегося в хромосомах, между двумя вновь возникающими клетками. В результате митоза из одной материнской клетки образуются 2 дочерние. Ядро каждой дочерней клетки имеет, как правило, такой же набор хромосом, какой был в исходной материнской клетке. Разделение же цитоплазмы и ее органелл (пластид, митохондрий, рибосом и др.) между дочерними клетками совершается не с такой правильностью, поэтому дочерние клетки не всегда бывают одинаковыми по размеру, форме и включениям в цитоплазму. Между двумя митотическими делениями клетка растет, функционирует, подготавливаясь к последующему митозу. Это состояние клетки называется интерфазой. В интерфазе ядро имеет шаровидную или эллипсоидную форму и сравнительно гомогенное строение. В нем бывает хорошо видно одно или несколько ядрышек. В интерфазе идет подготовка клетки к митозу, протекают сложные биохимические процессы: редупликация (удвоение) молекул ДНК, синтез простых белков (гистонов) и других веществ, необходимых для прохождения митотического цикла. В интерфазе различают 3 периода: G1 (пресинтетический), S (синтетический, на котором происходит синтез ДНК) и G2(постсинтетический). В процессе митоза различают 4 последовательно идущие фазы: профазу, метафазу, анафазу и телофазу (рис. 1). Профаза. Различают раннюю и позднюю профазу. На ранней профазе ядро клетки сохраняет тот же вид, что и в интерфазе, но в нем появляются нити хроматинового вещества. В поздней профазе усиливается спирализация хроматиновых нитей, в результате чего они приобретают форму, присущую хромосомам данного вида, становятся более плотными и короткими.  Рис. 1. Митоз в клетках корешка лука: 1-интерфаза; 2,3— профаза; 4 — метафаза; В — анафаза; 6 — телофаза; 7 — цитокинез. Каждая хромосома, состоящая из двух хроматид, спирально скрученных и соединенных центромерой, четко проявляется. В конце профазы происходит фрагментация ядерной оболочки и исчезновение ядрышек. Метафаза. В этой фазе хромосомы концентрируются в центре клетки и располагаются в одной плоскости, образуя так называемую метафазную (экваториальную) пластинку. Центромера каждой хромосомы, скрепляющая обе хроматиды, располагается строго в плоскости экватора клетки, а плечи хромосом бывают вытянуты более или менее параллельно нитям веретена. В метафазе хорошо выявляется число хромосом, форма и строение каждой хромосомы, особенно если рассматривать клетку с полюсов. В метафазе окончательно формируется митотический аппарат— ахроматиновое веретено. Оно состоит из нитей, тянущихся от одного полюса клетки к другому. Нити веретена состоят из фибриллярных белков. Анафаза. Эта фаза митоза начинается с одновременного деления центромер всех хромосом данной клетки. Сразу же после деления центромер хроматиды каждой хромосомы начинают отталкиваться друг от друга и расходиться к противоположным полюсам клетки. В это время их уже следует называть сестринскими (дочерними) хромосомами. Все сестринские хромосомы начинают двигаться к полюсам одновременно и довольно быстро. В первую очередь отталкиваются центромерные участки хромосом, а затем — конечные участки плеч. Если хромосома по какой-либо причине утратила центромеру, то она не может самостоятельно двигаться к полюсу и нарушает картину нормального течения анафазы. Фрагмент такой хромосомы может сохраниться в клетке только в том случае, если он присоединится к другой хромосоме, имеющей центромеру. Движение хромосом в анафазе происходит при взаимодействии двух процессов: сокращения тянущих нитей веретена, связывающих, хромосомы с полюсами клетки, и удлинения опорных нитей веретена, связывающих оба полюса. Телофаза. В начале телофазы заканчивается движение хромосом и в клетке начинаются структурные преобразования: дочерние хромосомы деспирализуются и утрачивают видимую индивидуальность. Образуется ядро, окруженное оболочкой, восстанавливаются ядрышки (одно или несколько) в том же количестве, в каком они были в ядре материнской клетки, происходит постепенное разрушение и разделение всего содержимого клетки. Этот процесс образования двух новых клеток называется цитокинезом, или плазмотомией. Он начинается с того, что в экваториальной части материнской клетки утолщаются нити веретена и между ними образуется клеточная перегородка. Выполнение задания. Изучать фазы митоза лучше всего на постоянных препаратах продольных срезов корешков лука или других растений. Для этой цели корешки фиксируют по Навашину, окрашивают гематоксилином по Гейденгайну. Если нет постоянных микротомных препаратов, можно использовать давленные временные или полупостоянные препараты. Препарат помещают на столик микроскопа, при объективе Х9 находят соответствующую фазу митоза, затем переводят на объектив Х40 или X90, изучают и. зарисовывают клетки, находящиеся в различных фазах митоза, обращая внимание на состояние ядра, ядерной оболочки, ядрышка, цитоплазмы. Особенно внимательно следует рассмотреть состояние хромосом в каждой фазе митоза. №2 практическая работа. Знакомство с материалами и оборудованием цитогенетического практикума. Задание. 1. Ознакомиться с устройством микроскопа. 2. Установить микроскоп в рабочее положение. 3. Освоить работу с иммерсионной системой. Материал и оборудование. 1. Постоянный препарат. 2. Микроскоп. 3.Осветитель. Пояснения к заданию. Для проведения цитологических исследований в генетике чаще всего пользуются микроскопами МБР-3, М.БИ-3 или МБИ-6. Для занятий лучше всего использовать микроскопы МБР-1, МБР-3. К микроскопу типа МБР-3 должен быть придан осветитель ОИ-19, обеспечивающий оптимальное освещение препарата. Микроскоп соединяется с осветителем соединительной планкой. Осветитель ОИ-19 состоит из корпуса и зажимного устройства, с помощью которого корпус осветителя закрепляется на вертикальной колонке в определенном положении. Источником света в осветителе служит специальная лампочка СУ-61 (8 В, 20 Вт), которая питается .через понижающий трансформатор. Для регулировки накала лампочки в корпусе трансформатора имеется реостат с рукояткой, а для включения тока — выключатель. Выполнение задания. 1. Установить микроскоп в удобное для работы положение. Бинокулярную насадку привести также в положение, удобное для глаз работающего (сдвинуть или раздвинуть окуляры). 2. Тщательно протереть чистой мягкой тряпочкой и специальной кисточкой все части микроскопа — окуляры, объектив, зеркало и др. 3. Правильно установить объективы в револьвере. Они должны стоять последовательно (Х9, Х40, Х90) по часовой стрелке. 4. С помощью соединительной планки установить осветитель ОИ-19 перед микроскопом и через трансформатор включить его в сеть. Поворачивая корпус осветителя, направить световой поток на плоское зеркало. С помощью зеркала направить свет в объектив. 5. Поместить исследуемый препарат в препаратоводитель и сфокусировать его при объективе Х9. 6. Конденсор микроскопа поднять в верхнее положение и закрыть полевую диафрагму. Отверстие диафрагмы осветителя уменьшить до 1—2 мм. На плоское зеркало положить листок белой бумаги. Перемещая лампочку вдоль оси, добиться четкого изображения нити лампочки на бумаге. 7. Снять бумагу с зеркала и, двигая корпус осветителя, переместить изображение нити лампочки в центр полевой диафрагмы. 8. Слегка перемещая вверх и вниз конденсор, получить резкое изображение диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа (она имеет вид окружности ярко освещенного кружка). 9. Слегка поворачивая зеркало, установить изображение диафрагмы осветителя в центре поля зрения микроскопа. После этого диафрагму осветителя следует немного открыть (диаметр около 1,5 см). 10. Опустить конденсор, .чтобы обеспечить равномерное освещение всего поля зрения. 11. Чтобы определить оптимальный диаметр отверстия полевой диафрагмы, ее вначале нужно закрыть полностью, а затем, глядя в окуляр, слегка приоткрыть, чтобы ее края совпадали с краями задней линзы объектива. 12. Еще раз проверить фокусировку объекта при объективе Х9. Пользуясь препаратоводителем, установить в поле зрения исследуемую часть препарата — клетку с метафазной пластинкой при изучении кариотипа или подсчете хромосом, зародышевый мешок и т. д. 13. Исследовать препарат можно либо при объективе Х40, либо при иммерсионном объективе Х90. В последнем случае сразу после установки соответствующего объектива следует поднять конденсор, чтобы обеспечить лучшее освещение объекта. 14. При работе с иммерсионным объективом Х90 нужно предварительно сфокусировать и центрировать объект при объективе Х40, затем нужно нанести по капле иммерсионного масла на верхнюю линзу конденсора и покровное стекло и установить объектив Х90. 15. После окончания работы с линзы конденсора, объектива микроскопа и препарата иммерсионное масло удаляют чистой тряпочкой, смоченной бензином. 16. Во время перерыва и после окончания работы препарат вынимают, микроскоп устанавливают на объектив Х9 и накрывают чехлом. Осветитель выключают из сети во избежание его перегрева. №3 практическая работа. Составление картограмм. Вычисление и анализ линейных параметров хромосом. Задание. 1. Ознакомиться с особенностями морфологической классификации хромосом по Г. А. Левитскому. 2. На постоянном препарате найти хорошие метафазные пластинки и зарисовать хромосомы. Материал и оборудование. 1. Постоянный препарат поперечного среза корешка ржи или другого растения. 2. Микроскоп. 3. Рисовальный аппарат или окулярная сетка. 4. Окуляр-микрометр. 5. Карандаш. 6. Иммерсионное масло. Пояснения к заданию. Хромосомы каждого вида растений или животных имеют свои морфологические особенности и определенные размеры. Строение хромосом лучше всего выявляется в метафазе митоза, когда они укорочены и расположены в экваториальной плоскости.  12 3 4 5 6 7 8 9 Рис. 2. Различные типы хромосом: 1,7 — метацентрические (равноплечие); 2 — субметацентрическая (слабо неравноплечая); 3,4, 5 — акроцентрические (резко неравноплечие); 6 —телоцентрическая; 8 — акроцентрическая со вторичной перетяжкой; 9 — спутничная. Центромеры обозначены светлым кружком. Г. А. Левитским в 1931 г. разработана методика описания морфологии хромосом. Им же были разработаны способы фиксации, позволяющие выявить морфологические особенности строения хромосом. Изучение морфологии хромосом, измерение длины каждой хромосомы и ее частей привело Г. А. Левитского к мысли о наличии единого принципа построения хромосом, как бы они не были различны по форме на первый взгляд. Каждая метафазная хромосома имеет вид толстой нити различной длины и обязательно имеет центромеру (кинетохор), к которой прикрепляется нить веретена, осуществляющая в митозе расхождение хроматид к полюсам клетки. Центромера может находиться в разных частях хромосом, но местоположение ее специфично для соответствующей хромосомы данного вида. Центромера делит хромосому на 2 плеча и тем самым определяет ее форму (рис. 2). Если центромера лежит строго посредине, то хромосома называется равноплечей, или метацентрической. Если центромера располагается ближе к тому или другому концу, то хромосомы называются неравноплечими, или акроцентрическими. Разница между длиной плеч может колебаться в довольно широких пределах. Если меньшее плечо представлено ничтожно малым участком хромосомы, ее называют палочковидной, или телоцентрической. Участок плеча хромосомы, расположенный ближе к центромере, называют проксимальным, а отдаленный от центромеры — дистальным. Отношение длины большого плеча. Длине меньшего называют плечевым индексом. Метацентрические хромосомы имеют плечевой индекс 1—1,3, субметацентрические—1,4—1,6, акроцентрические— 1,6 —3 и более.  Рис. 3. Хромосомы скерды зеленой (Crepis capillaris); одинаковыми буквами помечены гомологичные хромосомы. Кроме положения центромеры, форму хромосомы определяет так называемое вторичное расчленение — наличие на концах хромосом своеобразных придатков различной величины и формы, отделенных от хромосомы вторичной акинетической перетяжкой (ниточкой или стерженьком). Придаток хромосомы С. Г. Навашин назвал спутником. Спутники сильно варьируют по форме и величине. Выполнение задания. Удобное растение для изучения строения хромосом — скерда зеленая (рис. 3). Строение хромосом лучше всего изучать у видов, имеющих их небольшое число; из культурных растений — лук, рожь, кормовые бобы, горох и некоторые другие. Для приготовления постоянных препаратов лучше использовать фиксатор Левитского, состоящий из 10%-ного формалина и 1%-ной хромовой кислоты, смешанных в различных пропорциях (7:3; 4:6; 5:5 и т. д.). Эти пропорции для вида растений обычно подбирают эмпирически. Окрашивать препараты лучше всего реактивом Шиффа по Фельгену, но можно также гематоксилином по Гейденгайну, ацетокармином или ацетоорсеином. Постоянные препараты, приготовленные для изучения морфологического строения хромосом, рассматривают под микроскопом при объективе Х9 и окуляре Х15 и отмечают хорошие метафазные пластинки. Затем при иммерсионном объективе Х90 и окуляре ХЮ с помощью рисовального аппарата или окулярной сетки карандашом рисуют контуры каждой хромосомы. На рисунке следует отметить местонахождение центромеры, а также спутника и акинетической перетяжки (если они имеются). Затем с помощью окуляр;микрометра, цена деления которого заранее определена, измеряют в микронах длину каждого плеча хромосомы, определяют отношение короткого и длинного плеч хромосомы и составляют идиограммы хромосомных наборов изученных видов. №4-практическая работа. Знакомство с биологией и морфологией дрозофилы. Постановка опытов по скрещиванию дрозофил, различающихся по изучаемым признакам. Ряд разделов генетики — хромосомная теория наследственности, определение пола, множественный аллелизм, мутагенез и другие разработаны на дрозофиле (плодовой, или уксусной, мухе). Дрозофила — удобный объект для теоретических исследований. Она легко размножается в лабораторных условиях, имеет короткий цикл развития, исключительно плодовита, обладает четко выраженными морфологическими признаками. Благодаря большому числу спонтанных и индуцированных мутантных рас, часто характеризующихся четким проявлением измененных признаков, небольшому числу хромосом она может служить модельным объектом при проведении ряда лабораторных работ со студентами. Биология развития дрозофилы. Дрозофила— небольшая серая муха, длина тела которой около 3 мм, с ярко красными глазами, с нормально развитыми крыльями, превышающими по длине тело. Питается дрозофила ферментируемыми фруктами или овощами. В лаборатории ее разводят на специальной питательной среде. Яйцо дрозофилы длиной около 0,5 мм, снабжено двумя отростками, при помощи которых оно держится на поверхности среды. Самки откладывают яйца вскоре после оплодотворения. В благоприятных условиях каждая самка откладывает до 50—80 яиц в сутки, а всего в течение 3—4 суток она может отложить более 200 яиц. В лабораторных условиях личинки появляются из яиц через 20—24 ч после оплодотворения. Личиночный период состоит из трех стадий. Первая и вторая стадии заканчиваются линьками, третья — окукливанием, которое начинается примерно через 4 суток после вылупления из яйца. Первое время после вылупления личинок из яйца они находятся на поверхности среды, затем уходят вглубь, интенсивно питаются, а перед окукливанием покидают среду, перестают питаться и некоторое время ползают по стенкам стаканчика или пробирки. Затем они становятся неподвижными, значительно сокращаются в длину и приобретают характерную для куколки форму. В состоянии куколки они находятся примерно 4 суток.  Рис. 4. Дрозофила: 1 — самка; 2— самец.За это время разрушаются личиночные органы и формируются органы взрослой мухи. Только гонады и нервная система не претерпевают разрушения. В конце стадии куколки сквозь оболочку просвечивают темные участки тела, хорошо видны глаза, особенно, если они имеют яркую окраску. Молодые, только что вылупившиеся мухи, имеют более длинное желтоватое тело, почти лишенное пигмента, короткие, еще не расправленные крылья. Через 8 ч самки уже способны к оплодотворению. Для скрещивания необходимо брать девственных самок, не старше 8 ч после вылупления. Самки начинают откладывать яйца с конца вторых суток и продолжают до конца жизни мухи. Самки дрозофилы отличаются от самцов по чине и ряду других морфологических признаков (рис. 4). Они обычно несколько крупнее самцов, конец брюшка у них заостренный, в то время как у самца форма брюшка округлая. Последние сегменты брюшка у самок пигментированы значительно слабее, чем у самца. Кроме того, у самцов имеются так называемые половые гребешки в виде ряда крепких хитиновых щетинок на первом членике передних ног. Однако этот признак можно различить только под бинокулярной лупой, поэтому в практической работе ориентируются преимущественно на форму и пигментацию брюшка. Инвентарь и оборудование, необходимые при работе с дрозофилой. 1. Стаканчики из толстого стекла высотой 5—7 см и диаметром 2,5—3 см. 2. Тонкий глазной пинцет и мягкая кисточка. 3. Молочно-белое стекло размером 5 см X 10 см. 4. Бинокулярная лупа или небольшие настольные лупы различных конструкций с увеличением не менее Х4. 5. Часовое стекло. 6. Капельница для серного эфира. 7. Эфиризатор, или морилка. Эфиризатор может быть специальный любой конструкции, либо — обычный стаканчик, закрытый корковой пробкой с ватным тампоном. 8. Бутыль с небольшим количеством керосина или отходов спирта (1/4 часть ее объема). В эту бутыль выбрасываются ненужные мухи после анализа. 9. Вата для изготовления пробок. 10. Кастрюля и плитка для приготовления питательной среды. 11. Мензурка, весы, карандаш, этикетки, тушь. Питательные среды и их приготовление. Главные составные части питательных сред для дрозофилы — дрожжи и сахар. В питательную среду обычно добавляют агар-агар. Он придает среде желеобразную консистенцию. Агар-агар должен быть светлым, прозрачным, хорошо очищенным от химических примесей. Ниже приводится ряд наиболее распространенных и доступных рецептов приготовления питательных смесей, рассчитанных примерно на 50 пробирок. Рецепты наиболее распространенных сред
Изюм 150 г Агар-агар 6 г
Картофель 200 г Изюм 150 г Агар-агар 4г
Дрожжи 30 г Изюм 25 г Манная крупа 18 г Агар-агар 5 г Сахар 8 г
Дрожжи 40 г Манная крупа 13 г Сахар 13 г Агар-агар 4,5 г Методика приготовления среди по рецепту III. Дрожжи тщательно растирают и помещают в дистиллированную воду, налитую в алюминиевую кастрюлю или в фарфоровый стакан. Тщательно перемешивая, доводят до кипения. Из изюма предварительно удаляют косточки, тщательно промывают его, растирают в фарфоровой ступке и кладут в кипящую воду с дрожжами. Смесь варят на слабом огне при тщательном перемешивании в течение 45 мин. Затем в нее засыпают манную крупу и варят еще 25 мин. Агар-агар предварительно замачивают в дистиллированной воде в течение 30—40 мин, после чего кладут в кипящую среду и кипятят 3—5 мин. Если вода выкипит, ее добавляют до первоначального объема. Готовую среду охлаждают до 50—60 °С и разливают в тщательно вымытые и простерилизованные пробирки или стаканчики (примерно на 1 —1,5 см их высоты), покрывают чистой марлей и еще раз охлаждают до комнатной температуры. В таком виде среду можно использовать либо сразу после охлаждения, либо через некоторое время. Хорошо приготовленная среда может храниться в холодильнике 3—4 суток в стаканчиках или пробирках, закрытых ватными пробками. Перед тем как поместить мух на среду в стаканчики, поверхность среды засевают дрожжами. Для этого свежие дрожжи разводят в дистиллированной воде до консистенции сливок, мягкой кисточкой одну каплю переносят на поверхность среды и дают ей подсохнуть. В приготовленные таким образом стаканчики со средой переносят мух либо для размножения, либо специально подобранные пары для скрещивания. По такой же методике готовят среды и по другим рецептам. Дрожжи для приготовления сред должны быть обязательно свежими, среда не слишком твердой (молодые личинки не могут проникнуть в глубь твердой среды и погибают) и не слишком жидкой (в жидкой среде могут погибнуть отложенные яйца). Наркотизация мух. Анализ и подсчет мух, а также отбор девственных самок и подбор родительских пар для скрещивания проводят на матово-белом стекле под лупой после того, как их усыпят серным эфиром. Для этой цели мух помещают в эфиризатор (морилку) или, если специального эфиризатора нет, в обычную пробирку или стаканчик, в которых размножают мух. К. этому стаканчику подбирают плотную корковую пробку, в нижней части которой делают углубление. В это углубление вставляют плотный ватный тампончик, смачиваемый из капельницы по мере надобности 1—2 каплями серного эфира. Стаканчик с мухами осторожно постукивают об ладонь (мухи при этом собираются в нижней его части), затем осторожно снимают ватную пробку, накрывают стаканчик эфиризатором и опрокидывают так, чтобы стаканчик с мухами был наверху. Легким постукиванием стаканчика о ладонь всех мух переводят в эфиризатор и закрывают его пробкой с ватным тампоном, смоченным одной каплей эфира. Как только заснет последняя муха, их осторожно вытряхивают из эфиризатора на молочно-белое стекло и, пользуясь лупой и мягкой кисточкой, быстро подсчитывают, так как в наркотизированном состоянии они могут находиться только около 5 мин. Если наркотизацию следует продлить, мух накрывают большим часовым стеклом, под которое вкладывают ватный тампон, смоченный одной каплей эфира. Если эти мухи нужны для последующего размножения, их помещают в чистые пробирки с питательной средой, засеянной дрожжами. В одну пробирку для размножения следует помещать 2—3 самки и 3—5 самцов. Для того чтобы сонные мухи не упали на дно пробирки и не увязли в среде, их помещают на чистую стенку стаканчика со средой, и держат стаканчик в горизонтальном положении до тех пор, пока мухи не проснутся. По окончании работы с мухами их усыпляют и выбрасывают. От большой дозы эфира мухи погибают через 3—5 мин. О их гибели можно заключить по растопыренным кверху и в стороны крыльям и безжизненно вытянутым лапкам. Всю работу с дрозофилой и результаты наблюдений фиксируют в соответствующем журнале. Форма журнала может быть различной, но в нем должны быть точно зафиксированы дата постановки опыта или размножения линии, основные сведения о родительских парах, взятых для гибридизации, результаты анализа и т. д. |