- 2. Изучение характера роста S
- Опыт специфической трансдукции (демонстрация).
- 6. Опыт конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы , содержащего ген leu
- 7. Учет ПЦР при уреаплазмозе
- Рис. 31. Разделение в агарозном геле продуктов амплификации фрагментов генов микоплазм.
- Тема 10. ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. МИКР0ФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОТЕРАПИИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
Общая микробиология. Министерство здравоохранения РФ ярославская государственная медицинская академия
 Скачать 15.54 Mb.
|
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ1. Опыт по выявлению действия низких концентраций фенола на подвижность бактерий (модификационная изменчивость). Подвижную культуру P.vulgaris засевают по методу Шукевича на скошенный агар с добавлением 1% фенола. Через сутки инкубации в термостате при 370С выполняют пересев по методу Щукевича на скошенный агар. Демонстрация: среда № 1 - посев исходной культуры протея. Наблюдается ползучий рост по всей скошенной поверхности - культура подвижна. Среда № 2 - с добавлением фенола - рост только в точке нанесения культуры (культура неподвижна). Среда № 3 - пересев со среды с фенолом на среду без фенола - рост по всей скошенной поверхности (культура подвижна). Произошла реверсия признака. Делается вывод о модификационном характере изменчивости протея. 2. Изучение характера роста S (E.coli) и R (B. cereus) форм бактерий на плотной и жидкой питательных средах (демонстрация). 3. Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения (демонстрация). Объект облучают при красном свете бактерицидной лампой ВУФ-15 на расстоянии 60 см от его центра. Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, устанавливая оптимальную мутагенную дозу (0,1—1 % от числа выживших бактерий). Для получения lac-мутантов Е.coli испытуемую культуру, содержащую 2х 108 бактерий в 1 мл среды, выращивают в питательном бульоне в течение 14—18 ч. Бактерии осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль 1 л раствора MgSО4 и охлаждают во льду (для прекращения деления клеток). Затем суспензию в объеме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15—150 сек., после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона и инкубируют при 370 С в течение 14—18 часов. Затем из разведения 102—105 по 0,1 мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем. Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Например, ампициллин—10 мкг/мл, левомицетин— 5 мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл. На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные колонии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концентрацией антибиотика, являются к нему резистентными. Параллельно делают контрольные посевы. 4. Опыт трансформации (демонстрация). Реципиентом является стрептомициночувствительный штамм кишечной палочки - Escherichia coli Strs , донором - ДНК, выделенная из штамма Escherichia coli Strr , устойчивого к стрептомицину. Селективной средой для отбора рекомбинантов служит питательный агар со стрептомицином (100 ЕД/мл). К 1 мл бульонной культуры E.coli добавляют 1 мкг/мл ДНК донора, смесь инкубируют при 370 С в течение 30 мин, после чего в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы (для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма), и вновь инкубируют в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10–5 – 10-6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. Посев инкубируют при 370 С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма. На среде со стрептомицином реципиентная культура не должна расти, т.к. она чувствительна к стрептомицину. Частота трансформации определяется отношением количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма . Опыт специфической трансдукции (демонстрация). Реципиентом является штамм Е. coli lac-, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг—фаг λ dgal, часть генов которого замещена дефектным β -галактозидазным опероном Е. сoli, неспособным вызывать лизис кишечной палочки. На селективной среде Эндо лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного - красные колонии с металлическим блеском. К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага λ dgal (концентрация 106—107 бактерий в 1 мл). Смесь инкубируют при 370 С в течение 60 мин, затем готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с разведением 106 делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма. Частота трансдукции определяется отношением числа клеток рекомбинантов к числу клеток реципиентного штамма. 6. Опыт конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина (демонстрация). Донор — штамм Е. coli K12 Hfr leu+ Strs. Реципиент—штамм E. coli K12F- leu- Strr. Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином. К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 370 С в течение 30 мин, затем смесь разводят до 10–2 - 10-3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают штаммы донора и реципиента, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Культуру донорского штамма высевают также на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма—на полную среду (питательный агар с антибиотиками) для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 370 С. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным. 7. Учет ПЦР при уреаплазмозе (демонстрация, рис. 31).
Тема 10. ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. МИКР0ФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОТЕРАПИИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
