- Тема 12. УЧЕНИЕ ОБ ИНФЕКЦИИ. ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИЙ. РОЛЬ МАКРООРГАНИЗМА, ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ И СОЦИАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ В РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИИ. ФОРМЫ ИНФЕКЦИИ
- ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ Патогенность микроорганизмов. Экспериментальное воспроизведение инфекции
- САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ 1. Освоение основных способов заражения лабораторных животных
- 2. Изучение факторов патогенности микробов на примере St.aureus.
- 3. Освоение биологического метода диагностики.
- Самостоятельная работа студентов. Освоение биологического метода диагностики.
- Основные способы заражения лабораторных животных.
- Внутримышечное заражение.
- Внутрибрюшинное заражение.
- Изучение некоторых факторов патогенности бактерий. Гемолизин.
- Плазмокоагулаза
- Постановка биопробы с целью диагностики ботулизма.
- Вскрытие и бактериологическое исследование трупа белой мыши, павшей в результате биопробы.
Общая микробиология. Министерство здравоохранения РФ ярославская государственная медицинская академия
 Скачать 15.54 Mb.
|
Педиатрические аспекты темы
4. Поскольку молоко является основным продуктом питания детей (особенно 1 года жизни), соблюдение правил стерилизации и хранения молочных продуктов является обязательным с целью предупреждения кишечных инфекций. Весьма важным является также санитарно-бактериологическое исследование продуктов детского питания (молока, молочных смесей и молочно-кислых продуктов).
Тема 12. УЧЕНИЕ ОБ ИНФЕКЦИИ. ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИЙ. РОЛЬ МАКРООРГАНИЗМА, ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ И СОЦИАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ В РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИИ. ФОРМЫ ИНФЕКЦИИ Перечень конкретных учебно-целевых вопросов
ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ Патогенность микроорганизмов. Экспериментальное воспроизведение инфекции Возбудителями инфекционных заболеваний человека и животных являются патогенные (болезнетворные) микробы. Существуют условно-патогенные микробы, вызывающие инфекции только при определенных условиях, в частности, при снижении защитных сил организма или при попадании в организм очень большого количества микробов и т. д. Патогенность является видовым признаком микроба. Вирулентность – это количественное выражение патогенности. Факторами патогенности бактерий являются яды - экзо- и эндотоксины, капсулы, обладающие антифагоцитарным действием, ферменты (гиалуронидаза, фибринолизин, коагулаза и др.), способствующие проникновению микроорганизмов в ткани. Экзотоксины, выделяемые бактериальной клеткой при жизни в окружающую среду, являются термолабильными высокоядовитыми белками, обладающими избирательностью действия на определенные органы и ткани (гемотоксины, нейротоксины и др.). Микробы, продуцирующие экзотоксин (возбудители столбняка, дифтерии, ботулизма и др.), называются токсигенными. Получают экзотоксины путем фильтрования бульонной культуры через бактериальные фильтры. Эндотоксины являются термостабильными липополисахаридами оболочки бактерий, вызывающими неспецифическую интоксикацию организма в виде повышения температуры тела, головных и мышечных болей и т.д. Вирулентность может снижаться при длительном культивировании на искусственных питательных средах, пассажах через организм маловосприимчивых или невосприимчивых животных, под влиянием различных веществ и неблагоприятных факторов внешней среды. Повышения вирулентности можно достигнуть при пассажах микробов на высоковосприимчивых животных. Степень вирулентности микроорганизмов оценивается обычно по величине минимальной смертельной дозы (Dosis letalis minima- Dlm) –количеству микробных клеток, вызывающих гибель около 95% лабораторных животных определенного вида. DL50 вызывает гибель 50% лабораторных животных. Инфекционный процесс может быть воспроизведен на лабораторных животных, что используется для выделения чистой культуры возбудителя из различного материала (метод биопробы), изучения патогенности и вирулентности микроба, воспроизведения экспериментальной инфекции, а также испытания химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов. Для этих целей наиболее часто используют белых мышей, морских свинок, кроликов, белых крыс. В некоторых случаях исследования проводят на обезьянах, кошках, собаках, лошадях, крупном и мелком рогатом скоте, диких животных (хомяки, суслики, дикие крысы, полевки), птицах (куры, голуби и т. д.), а также куриных эмбрионах. Животных заражают подкожно, внутрикожно, накожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, перорально (через рот), интраназально (через нос в дыхательный тракт), в глаз, в мозг и т. д. Погибших животных вскрывают и подвергают микробиологическому исследованию. САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ 1. Освоение основных способов заражения лабораторных животных: а). Подкожное введение. Двумя пальцами левой руки поднимают кожу в области спины и в образовавшуюся складку правой рукой вкалывают иглу шприца, отклоняют ее в сторону и медленно вводят материал в объеме 0,5 мл. Складку кожи отпускают, на место инъекции накладывают ватный тампон, смоченный дезинфицирующим раствором, быстро вынимают иглу шприца. б). Внутримышечное введение. Иглу шприца вводят в толщу мышщ задней лапки, направляют под тупым углом к поверхности мышцы. Вводят 0,2 мл исследуемого материала. в). Внутрибрюшинное введение. Мышей держат головой вниз, чтобы кишечник сместился книзу от места инъекции. Производится прокол брюшной стенки в подвздошой области, при этом ощущают провал иглы в брюшную полость. Медленно вводят 0,5 мл заразного материала. 2. Изучение факторов патогенности микробов на примере St.aureus. а). Гемолизин. Произведен посев культуры стафилококка на кровяной МПА. Гемолизин определяют по образованию зон разрушения эритроцитов вокруг колоний. б). Плазмокоагулаза. Чистая культура стафилококка внесена в 1 мл стерильной плазмы крови. Реакция учитывается после инкубации при 370 С в течение 2 часов. При наличии у штамма стафилококка плазмокоагулазы наблюдается коагуляция плазмы. в). Дермонекротоксин. Кролику внутрикожно вводят 0,2 мл 2х-миллиардной взвеси стафилококка. При наличии некротоксина на месте инъекции образуется инфильтрат с последующим некрозом ткани. 3. Освоение биологического метода диагностики. Выполнить биопробу с целью диагностики инфекционного заболевания. Исследуемый материал введен белой мыши внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Провести вскрытие и бактериологическое исследование трупа белой мыши, павшей от экспериментальной инфекции. Способы введения исследуемого материала животным могут быть следующими: подкожный, внутрикожный, накожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный (через рот), иптраназальный (через нос), интрацеребральный (в мозг) и др. Подкожный способ введения. Кроликам материал вводят под кожу спины или другой части тела, морским свинкам - под кожу живота или бока, мышам и крысам - под кожу спины или затылка. Для подкожного введения кожу в месте введения предварительно освобождают ножницами от волос и смазывают дезинфицирующим раствором, затем захватывают двумя пальцами руки и у основания образовавшейся складки вкалывают иглу шприца, медленно вводят ее до половины, чуть отклоняя в сторону, чтобы не вылился вводимый материал. Затем складку кожи отпускают накладывают на иглу вату, смоченную спиртом или йодной настойкой, и быстро вынимают иглу. Впутржожный способ введения. Инъекцию делают тонкой иглой (№18-20). Удобно использовать туберкулиновый шприц. Кожу, освобожденную от шерсти, растягивают большим и указательным пальцами; иглу вводят под острым углом срезом вверх. Правильно введенная игла просвечивает сквозь эпидермис. Исследуемый материал вводят медленно (обычно в объеме 0,1 мл); на месте введения образуется пузырек с поверхностью, напоминающей лимонную корочку. Внутримышечное введение. Кроликам и морским свинкам материал вводят чаще всего в мышцу задней лапы, птицам - в мышцы груди. Виутрибрюшинное введение. Животное удерживают в вертикальном положении головой вниз, чтобы внутренние органы переместились к диафрагме. Иглу вводят в нижнюю часть живота. Для инъекций применяют короткие иглы. Момент проникновения иглы в брюшную полость воспринимается как "провал". Предельные дозы введения: мышам - 1; свинкам - 5; кроликам - 10 мл. Внутривенное введение. Кроликам материал вводят в краевую вену уха, мышам - в вену хвоста, морским свинкам - в сердце, птицам (курам, голубям) - в вену, расположенную на внутренней поверхности крыла, которая хорошо видна после выщипывания перьев. Участок кожи, вокруг расположения вены для лучшего ее наполнения следует предварительно протереть ватой, смоченной ксилолом или теплой водой. Нельзя допускать попадания пузырьков воздуха в шприц, т.к. это может стать причиной газовой эмболии. Введение через рот. Исследуемый материал примешивают к кор му либо вводят через гибкий резиновый катетер или зонд. Есть и другие способы, когда материал вводят в пищевод с помощью шприца с иглой, имеющей на конце оливу, или закапыванием в рот, причем каждую следующую каплю вводят только после того, как животное проглотило предыдущую. Введение через нос. Животному дают легкий наркоз, при этом инфекционный материал глубоко проникает в легкие. При глубоком наркозе дыхание поверхностное, материал плохо втягивается. Предельные дозы: для мышей - 0,03-0,05; крыс - 0,05-0,1; свинок и кроликов - до 2 мл. Введение в мозг. Мелким животным (крысам и мышам) материал вводят туберкулиновым шприцем с тонкой иглой, ограниченной металлической муфтой, на глубину 1,5 - 2 мм в количестве 0,01 - 0,02 мл. Мышь удерживают рукой так, чтобы большим и указательным пальцами можно было оттягивать кожу головы к затылку, а мизинцем и безымянным пальцами фиксировать хвост. Место инъекции смазывают йодом, укол делают на уровне средней трети линии, соединяющей внутренний угол глаза с основанием уха. Материал вводят медленно, чтобы не вызвать резкого повышения внутричерепного давления. Предельная доза для морских свинок - 0,1 мл; кроликов - 0,3 мл; более крупных животных - 0,5-0,8 мл. Вскрытие лабораторных животных и взятие материала для бактериологического исследования Павшие или заболевшие животные должны быть вскрыты. Больных свинок и мышей усыпляют с помощью эфирного наркоза. Кроликов умерщвляют путем введения 5 см3 воздуха в ушную вену. Вскрытие делают на специальном столе, соблюдая правила асептики. Перед работой надевают халат и резиновые перчатки. На столе должны быть: доска мягкого дерева, два скальпеля, два пинцета (хирургический и анатомический), ножницы прямые и купферовские, бактериологическая петля, банка с ватой, стекла предметные, горелка, стакан со спиртом и ватой па дне для инструментов, 2% и 5% раствор лизола, а также стерильные пробирки, чашки Петри, ватные тампоны, пипетки пастеровские, физиологический раствор и набор готовых питательных сред в чашках и пробирках. Перед вскрытием шерсть животного обмывают ватным тампоном, смоченным 2% раствором лизола, труп укладывают на доску, покрытую стерильной бумагой, животом вверх. Лапки широко раздвигают и прикалывают к доске иглами или привязывают к крюч кам по углам доски. После фиксации животного осматривают наружные покровы и разрезают кожу от лобка до нижней челюсти. По направлению передних и задних лапок кожу рассекают боковыми надрезами. Скальпелем отсепаровывают кожу от подкожной клетчатки, осматривают паховые и подмышечные лимфатические узлы. Из измененных лимфатических узлов готовят четыре мазка-отпечатка и производят посев на питательные среды. После этого приступают к вскрытию грудной и брюшной полостей, остерегаясь попадания дезинфицирующего раствора внутрь. Грудную полость вскрывают, подняв мечевидный отросток пинцетом, ножницами перерезают ребра в области хрящей. Осматривают грудную полость и при наличии изменений в органах из части их делают мазки-отпечатки и посевы на питательные среды. Из легких готовят три мазка-отпечатка. Обязательно исследуют кровь из сердца, для чего верхушку его прижигают раскаленным скальпелем и в этом месте, проколов мышцу стерильной пастеровской пипеткой, набирают кровь, готовят мазок и высевают на питательные среды. Брюшную полость вскрывают, придерживая пинцетом переднюю брюшную стенку, и ножницами рассекают ткани от лобка до диафрагмы, а боковыми надрезами к паху и у диафрагмы широко открывают брюшную полость, сохраняя неповрежденным кишечник. При осмотре органов брюшной полости особое внимание обращают на слизистую и печень. Из этих органов готовят мазки-отпечатки ( из селезенки - 2, а из печени -1) и делают посевы в соответствующие среды. Черепную коробку после удаления кожного покрова головы, вскрывают. Череп смазывают йодом и мелкой пилкой распиливают на уровне верхнего края глазницы, боковых затылочных костей и по наружному краю лобных костей. Крышку черепной коробки удаляют и производят посев из мозга. Головной мозг извлекают после пересечения спинного мозга на уровне большого затылочного отверстия. После вскрытия труп животного сжигают или автоклавируют, а при невозможности это сделать заливают на сутки 5% лизолом или 5% карболовой кислотой. Инструменты тщательно очищают от крови и стерилизуют кипячением в течение 40 мин, а доску для вскрытия заливают дезинфицирующим раствором. Мазки-отпечатки на предметных стеклах фиксируют в смеси Никифорова 10-15 мин, окрашивают и изучают. Посевы помещают в термостат. С этой целью после осмотра трупа животное прикрепляют к препаровальной доске, располагая его при этом брюшной стенкой вверх; кожу обрабатывают дезинфицирующим раствором. Н рабочем столе должны находиться доска или кювета, залитая парафином, спиртовка, сосуд со спиртом, инструментами (ножницы, скальпель, пинцеты и др.) и ватой на дне, стерильные ватные тампоны, бактериологическая петля, стерильные пастеровские пипетки, предметные стекла, необходимые питательные среды. Во избежание загрязнения содержимым кишечника сначала вскрывают кожу, тупо отсепаровывая ее от подкожной жировой клетчатки. Рассматривают место инъекции и регионарные лимфатические узлы. Пинцетом захватывают мечевидный отросток грудины, подтягивая его вверх. Вырезают грудину вместе с прилегающими отрезками ребер и ключицы. После вскрытия грудной полости раскаленным скальпелем прижигают верхушку сердца и стерильной пастеровской пипеткой прокалывают миокард. При этом в капилляр пипетки поступает кровь из сердца. Проводят посев крови на МПБ. Затем вскрывают брюшную полость, рассматривают внутренние органы, производят посевы-отпечатки из органов на сектора чашки Петри с МПА: прижигают поверхность органа раскаленным скальпелем, отрезают кусочек и делают посев-отпечаток на пластинчатый МПА из печени, почек, легких и селезенки. Параллельно готовят мазки-отпечатки, для чего кусочком органа прикасаются поверхностью разреза к предметному стеклу. Мазки фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают по Граму, микроскопируют; посевы отправляют в термостат. Во время вскрытия необходимо следить за тем, чтобы заразный материал не попадал на стол. Категорически запрещается класть на стол инструменты, применяющиеся для вскрытия трупа. После вскрытия рабочее место убирают и дезинфицируют. Труп животного помещают в дезинфицирующий раствор, сжигают или автоклавируют. Доску или кювету протирают спиртом и прожигают или заливают на сутки дезинфицирующим раствором. Инструменты стерилизуют кипячением или автоклавированием. Ход исследования оформляется протоколом. Самостоятельная работа студентов.
Биологический метод диагностики инфекционных болезней состоит в заражении материалом от больного чувствительных лабораторных животных с целью воспроизведения у них типичной картины заболевания и выделения чистой культуры бактерий. Биологический метод диагностики применяется при диагностике туляремии, чумы, бруцеллеза, ботулизма и других инфекционных болезней. Основные способы заражения лабораторных животных. Перед заражением животного шерсть в области инъекции патогенного материала выстригают ножницами и дезинфицируют кожу спиртом. Подкожное заражение. Двумя пальцами левой руки поднимают кожу в области спины и в образовавшуюся складку правой рукой вкалывают иглу шприца, отклоняют ее в сторону и медленно вводят материал в объеме 0,5 мл. Складку кожи отпускают, на место инъекции накладывают ватный тампон, смоченный дезинфицирующим раствором, быстро вынимают иглу шприца. Внутримышечное заражение. Иглу шприца вводят в толщу мышц задней лапки, направляют под тупым углом к поверхности мышцы. Вводят 0,2 мл исследуемого материала, Внутрибрюшинное заражение. Мышей держат головой вниз так, чтобы кишечник сместился книзу от места инъекции. Производится прокол брюшной стенки в подвздошной области, при этом ощущают провал иглы в брюшную полость. Медленно вводят 0,5 мл заразного материала. Внутривенное заражение (в краевую ушную вену кролика). Выщипывают шерсть вдоль края уха, протирают место инъекции спиртом, захватывают левой рукой ухо, располагая большой палец около места укола. Иглу вкалывают в вену по направлению тока крови параллельно поверхности уха. Надавливают на поршень шприца. Если поршень идет свободно и кожа вокруг вены не набухает, материал поступает в вену. После введения 0,5 мл исследуемого материала вену прижимают дистальнее места инъекции, извлекают иглу и прижимают к месту укола кусочек стерильной ваты во избежание кровотечения. Заражение через рот. Исследуемый материал смешивают с кормом или вводят через специальный резиновый или металлический зонд. Кроме того, животных можно заражать путем внутрикожного втирания материала, введением исследуемого интраназально, на конъюнктиву глаза или в мозг.
Гемолизин. Произведен посев культуры стафилококка на кровяной МПА. Гемолизин определяют по образованию зон разрушения эритроцитов вокруг колоний в виде просветления питательной среды. Плазмокоагулаза. Чистая культура стафилококка внесена в I мл стерильной цитратной плазмы крови кролика, разведенной 1:5. Реакция учитывается после инкубации при 370 С в течение 1,2, 4, 18 часов. При наличии у штамма стафилококка плазмокоагулазы наблюдается коагуляция плазмы с образованием студнеобразного сгустка. Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кислоту, которая перестает образовывать сгусток при добавлении уксусной кислоты. Для определения этого фермента в пробирку с гиалуроновой кислотой вносят суточную культуру бактерий или фильтрат бульонной культуры и инкубируют в течение 15 мин при 370 С. Затем добавляют 2—3 капли концентрированной уксусной кислоты. В пробах, где содержится гиалуронидаза, образования сгустка не происходит. Лецитиназа выявляется при посеве золотистого стафилококка на желточно-солевой агар, содержащий лецитин. Вокруг колоний, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском в виде радужного венчика. Дермонекротоксин. Кролику внутрикожно вводят 0,2 мл двухмиллиардной взвеси стафилококка. При наличии у культуры дермонекротоксина на месте инъекции образуется инфильтрат с последующим некрозом ткани. Постановка биопробы с целью диагностики ботулизма. Исследуемый материал (фильтрат, полученный из консервов домашнего приготовления – грибы), послуживший причиной отравления больного вводят белой мыши внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Мышь погибает с явлениями параличей.
После осмотра трупа животного прикрепляют к препаровальной доске, располагая его брюшной стенкой вверх; кожу обрабатывают дезинфицирующим раствором или спиртом. Во избежание загрязнения содержимым кишечника сначала вскрывают кожу, тупо отсепаровывая её от подкожной жировой клетчатки. Осматривают место инъекции и регионарные лимфатические узлы. Пинцетом захватывают мечевидный отросток грудины, подтягивая его вверх. Вырезают грудину вместе с прилегающими отрезками ребер и ключицы. После вскрытия грудной полости раскаленным скальпелем прижигают верхушку сердца и стерильной пастеровской пипеткой прокалывают миокард. При этом в капилляр пипетки поступает кровь из сердца. Проводят посев крови на МПА. Затем вскрывают брюшную полость, осматривают внутренние органы, производят посевы-отпечатки из органов на сектора чашки Петри с МПА. С этой целью прижигают поверхность органа раскаленным скальпелем, отрезают кусочек и делают посев-отпечаток на пластинчатый МПА. Параллельно готовят маэки-отпечатки из печени, почек, легких и селезенки, для чего кусочком органа прикасаются поверхностью разреза к предметному стеклу. Мазки фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают по Граму, микроскопируют; посевы помещают в термостат. Во время вскрытия необходимо следить за тем, чтобы заразный материал не попадал на стол. Запрещается класть на стол инструменты, применяющиеся при вскрытии трупа. После вскрытия рабочее место убирают и дезинфицируют. Труп животного помещают в дезинфицирующий раствор. Ход исследования оформляется протоколом по следующему образцу: Протокол № 3 Бактериологическое исследование трупа белой мыши, павшей в результате биопробы.
|