Искусство
Языки
Языкознание
Вычислительная техника
Информатика
Финансы
Экономика
Биология
Сельское хозяйство
Психология
Ветеринария
Медицина
Юриспруденция
Право
Физика
История
Экология
Промышленность
Энергетика
Этика
Связь
Автоматика
Математика
Электротехника
Философия
Религия
Логика
Химия
Социология
Политология
Геология
Хроматографические методы. Хроматографические методы в контроле качества лекарственных средств
 Скачать 150.5 Kb.
|
|
Министерство здравоохранения и социального развития РФ ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Кафедра фармацевтической и токсикологической химии Хроматографические методы в контроле качества лекарственных средств Ярославль 2009 Введение Хроматография в различных ее вариантах относится к физико-химическим методам и предназначена преимущественно для разделения многокомпонентных смесей. Она незаменима при исследовании метаболизма, изучении и разделении комплекса действующих веществ лекарственных растений, химико-токсикологических экспертизах, обнаружения фальсифицированных фармацевтических продуктов. Создателем метода является русский ученый ботаник М.С. Цвет (1903г), впервые разделивший на колонке, заполненной карбонатом кальция, растительный пигмент хлорофилл на отдельные компоненты. Название метода происходит от двух греческих слов «хромос» - цвет, «графо» - пишу, что в переводе означает «цветопись». Впервые официальным метод стал в 1961 г со времени введения в ГФ IX двух его вариантов: ионообменной хроматографии и хроматографии на бумаге. В 1968 г в ГФ Х, кроме двух, указанных выше, введена хроматография в тонком слое сорбента, а с 1987 г (ГФ ХI) стали фармакопейными газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография. Определение хроматографии как метода Хроматография – это физико-химический метод разделения веществ, основанный на различии в скорости их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. как наука Хроматография - наука о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. как процесс Хроматография - это процесс, основанный на перемещении дискретной зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы и связанный с многократно повторяющимися процессами сорбции и десорбции, разделяемых веществ между подвижной и неподвижной фазами. Классификация хроматографических методов Единой и общепринятой классификации хроматографических методов не существует, имеется несколько принципов. I. В зависимости от цели назначения: - аналитическая – установление качественного и количественного состава смесей; - препаративная – получение вещества в чистом и особо чистом виде; - промышленная – получение индивидуальных веществ, например, лекарственных препаратов в больших количествах. II. По агрегатному состоянию фаз, в которых проводится разделение: - газовая; - газо-жидкостная; -жидкостная. III. По форме проведения процесса: - плоскостная (на бумаге, в тонком слое сорбента); - колоночная; - капиллярная. IV. По механизму, лежащему в основе разделения: - адсорбционная, основанная на обратимой избирательной сорбции компонентов смеси из растворов или газовой фазы; - распределительная, основанная на различии в распределении веществ между двумя несмешивающими фазами – подвижной и неподвижной; - хемихроматография, разделение с участием химических процессов – реакций осаждения (осадочная), комплексообразования (комплексообразовательная), окисления-восстановления (окислительно-восстановительная), обмена ионами (ионообменная). Рассмотренные принципы классификации приведены в таблице 1. Таблица 1 Классификация хроматографических методов
Ионообменная хроматография Ионообменная хроматография (ИОХ) - основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов электролита, содержащихся в растворе на подвижные ионы, входящие в состав ионообменного сорбента – ионита. Иониты, являющиеся неподвижной фазой в этом виде хроматографии, представляют собой нерастворимые органически или неорганические соединения, естественного или искусственного происхождения. Наибольшую практическую значимость имеют иониты органической природы – фенолформальдегидные смолы, производные полистирола, получаемые на основе реакций полимеризации или поликонденсации. В зависимости от характера ионогенных групп (кислотные или основные) иониты делятся на катиониты и аниониты. Кроме катионитов и анионитов существуют амфолиты (амфотерные иониты), которые проявляют себя как катиониты или аниониты в зависимости от условий их применения. Катиониты содержат группы, способные к обмену катионами, например, -SO3H, -СООН. Катиониты подразделяются на сильнокислотные и слабокислотные. Сильнокислотные содержат сульфогруппы - SO3H, слабокислотные содержат карбоксильные группы -СООН, фенольный гидроксил –ОН. Н+-формой катионита называют сорбент, содержащий обменные ионы водорода; солевой формой – сорбент, содержащий катионы металлов, например, Nа+. Аниониты содержат группы, способные к обмену анионами. Они, как правило, представляют собой полиамины, в структуру которых входят четвертичные аммонийные, пиридиновые, третичные, вторичные и первичные аминогруппы. Аниониты подразделяются на сильноосновные и слабоосновные. Первые содержат четвертичную аммонийную группу –N+=(R)3; пиридиновую. Вторые – первичные, вторичные и третичные аминогруппы. ОН- формой анионита называют сорбент, содержащий обменные ионы гидроксила; солевой формой – сорбент, содержащий, аниониты кислот, например, СL-, Br-, СО32-. Схема ионного обмена: - на катионите R-SO3H + NaCL → RSO3Na + HCL -на анионите R-OH + NaCL → RCL + NaO Практическое применение Ионообменная хроматография используется в фармакопейном анализе и внутриаптечном контроле качества для количественного определения лекарственных веществ в субстанциях, ингредиентов многокомпонентных лекарственных форм, определения ингредиентов, мешающих анализу друг друга. Следует отметить, что ионообменная хроматография является косвенным методом определения действующего вещества, т.к. количественному анализу в фильтрате подвергается другое вещество, образующееся в эквивалентном количестве в результате ионного обмена на сорбенте. Хроматография в тонком слое сорбента Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ) - один из простейших методов хроматографического анализа, разделение компонентов происходит при перемещении подвижной фазы через нанесенный на подложку (пластинку) тонкий слой сорбента. Продвижение элюента (подвижная фаза) по сорбенту (неподвижная фаза) обеспечивается капиллярными силами. Подложки для сорбента (пластинки) изготавливаются из стекла, алюминиевой фольги или полиэфирной пленки. В ТСХ используют сорбенты неорганической и органической природы. Наиболее часто применяют силикагели различных марок, алюминия оксид, крахмал, целлюлозу, полиамидный порошок. Пластинки с тонким слоем сорбента могут быть приготовлены вручную самим экспериментатором или же использованы выпускаемые промышленным способом: импортные типа «Силуфол» и «Меrк» или отечественные «Сорбифил», «Силицел», пластины для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). Выпускаются пластинки, содержащие в слое сорбента добавки неорганических люминофоров и позволяющие идентифицировать вещества в УФ-свете – «Силуфол УФ-254» и «Силуфол УФ-366» (числа показывают длину волны УФ-света в нм, которым следует облучать пластинку после хроматографирования исследуемых веществ). Слой сорбента на пластинке может быть закрепленным или незакрепленным. При работе с незакрепленными слоями чаще всего используют алюминия оксид, который равномерно распределяется по пластинке нужного размера с помощью стеклянной палочки или специального устройства. При работе с закрепленным слоем его фиксируют на пластинке с помощью гипса или крахмала, которые добавляют в количестве 5% от массы сорбента. В основе разделения веществ в ТСХ преимущественно лежат процессы распределения и адсорбции. Распределительная хроматография основана на непрерывном перераспределении хроматографируемых веществ между двумя фазами, одна из которых неподвижна. Величиной, характеризующей процесс разделения в распределительной хроматографии, является коэффициент распределения (Кр), который определяется как отношение концентраций исследуемого вещества в неподвижной (Сн) и подвижной (Сп) фазах: Кр=Сн/Сп Коэффициент распределения зависит от природы вещества, природы растворителя, температуры и техники проведения эксперимента. Различие в распределении компонентов между двумя фазами, обусловленное различным сродством к подвижному растворителю, определяет и неодинаковую скорость их движения по пластинке, что и приводит к разделению. Наибольшая скорость движения наблюдается у того компонента смеси, который имеет наименьший Кр между подвижным и неподвижным растворителем. Наряду с распределением между двумя несмешивающимися фазами в процессе разделения веществ в ТСХ непрерывно протекают явления сорбции и десорбции, которые зависят от природы вещества, природы сорбента, компонентов подвижной фазы. Для эффективного разделения компонентов смеси важен рациональный выбор сорбента и подвижной фазы. Стадии метода хроматографии в тонком слое Проведение анализа методом ТСХ включает следующие этапы:
В процессе хроматографирования все пространство камеры должно быть насыщено парами подвижной фазы. При недостаточном насыщении вследствие неравномерного испарения растворителя пластинки возможно увеличение пробега вещества от середины к краям пластины («краевой эффект»). Насыщение камеры может быть достигнуто с помощью смоченной подвижной фазой фильтровальной бумаги, которой обкладывают стенки камеры. Время насыщения различно – оно определяется свойствами растворителями, входящих в состав подвижной фазы, и объемом камеры.
В качестве «свидетелей» («метчиков») используют Государственные стандартные образцы (ГСО), рабочие стандартные образцы (РСО) и стандартные образцы веществ свидетелей (СОВС).
Объем и количество наносимого на пластинку исследуемого раствора зависит от цели анализа и характера анализируемого объекта. Нанесение больших количеств веществ приводит к образованию пятна исследуемого вещества, часто растянутого вдоль движения подвижной фазы, что может помешать идентификации других веществ, содержащихся в меньших количествах, если они находятся на хроматограмме достаточно близко. Пробы наносят на так называемую линию старта, которую проводят иглой на расстоянии не менее 1,5 см от того края пластинки, который будет погружен в подвижную фазу. Минимальное расстояние между пробами 1 см. При нанесении поступают таким образом, чтобы диаметр наносимого раствора был как можно меньшим и компактным во избежание последующего «растекания» пятен исследуемых веществ по хроматограмме. Пробы подсушивают на воздухе до полного удаления растворителя.
Растворитель тотчас же начинает двигаться по пластинке – заметна горизонтальная полоса – фронт движения растворителя. При прохождении через точки, в которые нанесены пробы исследуемой смеси, начинают протекать процессы распределения и адсорбции, в зависимости от которых вещества смеси располагаются на разном удалении от линии старта. Оптимальной длиной пробега растворителя считают 10 см (заранее отмечают на хроматограмме), но она может меняться в зависимости от конкретной цели, разделяющей способности сорбента и подвижной фазы. Время хроматографирования зависит от толщины слоя сорбента, его природы, состава подвижной фазы.
Обнаружить зоны отдельных ингредиентов на хроматограмме можно следующими способами: Физическими: - по собственной окраске, если хроматографируемое вещество окрашено; - по флуоресценции веществ при облучении пластин УФ-светом. Химическими – по окраске пятен, получаемых в результате реакций, проходящих при обработке парами или опрыскивании хроматограмм какими-либо реагентами, образующими окрашенные соединения с исследуемыми веществами. Подобные реагенты должны быть высокочувствительными, т.к. количество вещества на хроматограмме очень мало. Обычно после обработки реагентами пластинки подсушивают, пятна исследуемых веществ на хроматограмме обводят иглой, отмечают центр пятна.
Положение вещества на хроматограмме характеризуется величиной Rf, называемой коэффициентом подвижности. Она представляет собой отношение расстояния, пройденного веществом к расстоянию, пройденным растворителем. Расстояние, пройденное веществом, определяется как расстояние от линии старта до центра пятна (рис. 1). Величина Rf является качественной характеристикой данного вещества для конкретных условий и зависит от природы сорбенты, толщины слоя, природы подвижной фазы, температуры, длины пробега растворителя. В некоторых случаях при определении подлинности используют величину Rs, представляющую собой отношение Rf анализируемого вещества к Rf вещества, принимаемого за стандарт (эталон, свидетель). Качественный анализ (идентификацию компонентов) проводят по величине Rf или с помощью стандарта («свидетеля», «метчика») того вещества, наличие которого предполагают в анализируемой смеси.
h2 h1 Рис. 1. Образец хроматограммы с обозначениями для расчета Rf Rf = h1/ h2 h1 – расстояние, пройденное веществом; h2 – расстояние, пройденное растворителем. Rs = Rf 1/ Rf ст Rf 1 – коэффициент подвижности анализируемого вещества; Rf 2 - коэффициент подвижности стандарта. 9. Количественный анализ компонентов исследуемой смеси. Количественный анализ компонентов анализируемой смеси с применением ТСХ может осуществляться двумя способами: - непосредственно на хроматограмме без экстракции разделенных веществ; - после элюирования (экстракции, вымывания) вещества с хроматограммы подходящим растворителем и анализа элюата с использованием, как правило, высокочувствительного метода с учетом малого содержания анализируемого вещества. Непосредственно на хроматограмме вещества определяют методами планиметрии и денситометрии. Метод планиметрии заключается в определении площади пятна (в мм2) в сравнении с площадью пятна стандарта, содержание вещества в котором известно. Площадь пятна определяют с помощью планиметра – прибора, предназначенного для определения площадей плоских фигур произвольной формы, или, если прибор отсутствует – с помощью миллиметровой бумаги. При денситометрическом определении измеряют интенсивность окраски пятна анализируемого и стандартного вещества с помощью прибора – денситометра, а затем как в методе фотоэлектроколориметрии рассчитывают содержание вещества в анализируемой смеси. Методы второй группы, основанные на количественном анализе веществ после элюирования их с хроматограммы, применяют на практике значительно чаще. При этом может быть два варианта: - экстракция окрашенного продукта анализируемого вещества, образованного им с каким-либо цветореагентом, и последующее определение полученного раствора фотоэлектроколориметрическим или спектрофотометрическим методом; - экстракция неокрашенного вещества и последующее его определение подходящим для него методом: фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия и др. Элюирование вещества проводят в сосуде, куда предварительно соскабливают с пластинку ту зону сорбента, в которой находится пятно анализируемого вещества, добавляют определенный объем экстрагента, встряхивают, фильтруют и фильтрат анализируют. Практическое применение Хроматография в тонком слое сорбента нашла применение в фармакопейном, внутриаптечном контроле качества лекарств, токсикологическом анализе, при исследовании действующих веществ лекарственного сырья растительного и животного происхождения, в научных исследованиях, связанных с поиском, созданием и стандартизацией новых лекарственных средств. Она используется в целях установления подлинности лекарственных веществ, определения примесей в фармакопейных субстанциях и лекарственных формах из них в т.ч. для установления ориентировочного количественного содержания, разделения сложных лекарственных смесей на отдельные компоненты и их идентификации, установления количества и в комбинации с другими методами – строения метаболитов лекарственных веществ в химико-токсикологическом анализе из исследуемого объекта с последующим разделением и обнаружением веществ. Достоинства ТСХ: - простота оборудования и операций, что дает возможность применить этот метод в любой, даже мало оснащенной лаборатории; - быстрота анализа в сравнении с использованием классических методов разделения компонентов смесей; - эффективность анализа, что позволяет разделить смеси близких по химическому строению веществ (до 15 компонентов) при правильном подборе подвижной фазы и приемов анализа; - высокая чувствительность способов и реагентов, используемых для детектирования, позволяет анализировать очень малые количества анализируемых веществ; - широкий диапазон практического применения, что делает его универсальным; -возможность применения «агрессивных» (жестких) реагентов для детектирования зон исследуемых веществ и нагревания до высокой температуры; - разнообразие применяемых сорбентов. Газовая, газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография. Краткая характеристика Анализ с использованием газовой (ГХ), газожидкостной (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) осуществляется с помощью приборов – хроматографов. ГХ и ГЖХ имеют много общего: - анализируемое вещество (или смесь веществ) находится в виде газа или пара, в который они превращаются в специальном устройстве приборе – испарителе; - подвижной фазой является газ (водород, гелий, азот); - одинаковые принципы регистрации результатов. Отличие между ними - в механизме распределения: - в ГХ – это динамические процессы сорбции и десорбции между газовой фазой и твердым сорбентом; - в ГЖХ – распределение между газовой фазой и высококипящей жидкостью, нанесенной в виде тонкой пленки на твердый сорбент. В основе разделения веществ методом ВЭЖХ лежит обратимая сорбция вещества между жидкостью, подаваемой в колонку под высоким давлением, и твердой фазой колонки. Основные характеристики методов приведены в таблице 2. Таблица 2 Основные характеристики ГХ, ГЖХ и ВЭЖХ
Основными узлами приборов для хроматографии являются: устройство для ввода пробы, устройство для подачи элюента (газа или жидкости), хроматографическая колонка, детектор, блок регистрации и обработки результатов анализа. Анализируемую пробу вводят либо микрошприцом, либо с помощью специального устройства – дозатора. Хроматографическая колонка представляет собой прямую, спиральную или V-образную трубку, изготовленную из стекла или нержавеющей стали, с внутренним диаметром от 0,6 до 5 мм, длиной от 1 до 2 м. В качестве адсорбента (неподвижной фазы) применяют материалы на основе кремнезема (хроматоны, цеолиты), фторуглеродных полимеров (тефлон, полихром), полистирола и дивинилбензола (полисорбы) и др. Размер частиц сорбента от 0,1 до 0,5 мм. ВГЖХ сорбент обрабатывают высококипящей жидкостью, образующей на нем тонкую пленку, в слое которой происходит процесс распределения анализируемых веществ, растворенных в потоке газа-носителя, движущегося через колонку. В качестве таких носителей используют вазелиновое и силиконовое масла, фталаты (дибутил-, диоктил-, и др.), ДМФА, полигликоли и др. в количестве 1-20% от массы сорбента. Выходящие из колонки компоненты анализируемой смеси в токе газа-носителя поступают в детектор, который реагирует на изменение какого-либо физического свойства проходящей через него газовой смеси. Показания преобразуются в электрический сигнал и передаются записывающему устройству (прибору), например, на ленту потенциометра. Существует несколько типов детекторов, чаще других используются детектор по теплопроводности (катарометр) и плазменно-ионизационный. Действие детектора по теплопроводности основано на измерении теплопроводности газа-носителя в присутствии других веществ. Действие плазменно-ионизационного детектора основано на измерении электропроводности пламени водородной горелки при прохождении через нее газовой смеси, выходящей из колонки. Детектор на выходе из колонки автоматически непрерывно определяет количество разделяемых соединений в подвижной фазе. Сигнал детектора регистрируется самописцем, полученная при этом диаграмма называется хроматограммой. Хроматограмма – это кривая, отображающая зависимость концентрации анализируемых веществ в элюате от времени. Каждое вещество на хроматограмме образует кривую, которую называют пик. Критерии хроматографических процессов Удерживание является основным критерием хроматографического процесса и описывается уравнением: Vr = Vo + KVs Vr - удерживаемый объем вещества или объем элюента, прошедший через колонку за время удерживания вещества; Vo - мертвый объем или удерживаемый объем несорьируемого компонента; К – коэффициент распределения; Vs - объем неподвижной фазы. Эффективность – критерий оценки хроматографической колонки. Эффективность характеризуется числом теоретических тарелок и высотой эквивалентной теоретической тарелке. Теоретическая тарелка (ТТ) - это условный участок хроматографической колонки, в пределах которого устанавливается равновесие вещества, распределенного между подвижной и неподвижной фазами (одна теоретическая тарелка отвечает однократному распределению между фазами). Число теоретических тарелок (N) рассчитывается по формуле:  Чем выше N в системе, тем лучше хроматографическое разделение. Высота эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ) – величина обратная теоретической тарелке. Рассчитывается по формуле: ВЭТТ = L/N L – длина колонки; N – число ТТ. Хроматографическая система тем эффективнее, чем больше N и ниже ВЭТТ. Селективность колонки является основным фактором достижения хроматографического разделения. Селективность (L) – это отношение времени удерживания 2-х соседних компонентов в смеси. Селективность связана с различием во взаимодействии с подвижной и неподвижной фазами. Мера селективности определяется с помощью разрешения пика. Разрешение пика – это расстояние между максимумами пиков, выраженное в единицах ширины их пиков.  Чем выше Rs, тем разделение лучше. Разрешение хроматографических пиков зависит от следующих факторов: - селективность системы (L); -коэффициента распределения (Кр); -число ТТ (N). Связь между этими факторами выражается уравнением:  Следует отметить, что повышение эффективности хроматографической системы за счет повышения числа ТТ (N) означает замену имеющейся колонки на более эффективную (большей длины). Повышение селективности достигается путем замены подвижной фазы или изменения состава элюента. Качественный анализ хроматограмм проводится методом относительных удерживаний (объем или время), либо с помощью веществ-свидетелей. Время удерживания вещества (tr) – это время, прошедшее от введения пробы до выхода вещества из колонки. Время удерживания несорбируемого компонента (tm) – это время пребывания несорбируемого вещества в хроматографической колонке. tr’ – это исправленное (приведенное) время. Рассчитывается по уравнению: tr’ = tr - tm Совпадение времени удерживания двух веществ может служить доказательством их идентичности. Метод веществ-свидетелей заключается в последовательном получении хроматограммы анализируемой смеси и веществ-свидетелй, присутствие которых предполагают в ней обнаружить. Время выхода компонента из колонки при одних и тех же условиях разделения будет всегда постоянно и может служить качественной характеристикой данного вещества. Количественный анализ проводят по параметрам хроматографического пика - по его площади или высоте. При определении площади пика умножают его высоту на ширину, измеренную на половине высоте пика. S=h∙W0,5 S- площадь пика; h – высота пика; W0,5 - ширина пика на его полувысоте. Предварительно проводят калибровку прибора. Вводя точно известные количества анализируемого вещества и определяют, площадь пика, строят график зависимости площади (или высоты) от количества вещества.          W0,5  h   h0,5tm,Vm W   tr, Vr Рис. 2. Хроматографический пик и его основные параметры. tm, Vm – время или объем удерживания несорбируемого компонента; tr, Vr – время или объем удерживания вещества; h – высота пика; h 0,5 – полувысота пика; W – ширина пика у основания; W0,5 – ширина пика на полувысоте. Практическое применение газовой и газожидкостной хроматографии Исследуемая проба вводится в поток газа-носителя в специальном устройстве (нагревателе, испарителе), ее компоненты превращаются в летучие соединения и в токе газа-элюента проходят через колонку с сорбентом, где многократно протекают процесс сорбции, десорбции и распределения, в зависимости от которых вещества анализируемой смеси удерживаются в колонке разное время. Разделенные вещества током газа-носителя элюируются из колонки, регистрируются детектором и автоматически фиксируются на бумаге самописца в виде пиков (хроматограмм). Она служит основой для качественного и количественного анализа. В фармакопейном анализе методы ГХ и ГЖХ применяются для определения подлинности лекарственных средств, определения примесей и количественного определения, а также определении остаточных растворителей в лекарственных средствах. Особенности высокоэффективной жидкостной хроматографии (жидкостной хроматографии высокого давления) Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является вариантом жидкостной колоночной хроматографии. Неподвижная фаза – твердый сорбент, подвижная - жидкость, подаваемая в колонку под повышенным давлением. Разделение компонентов смеси достигается за счет различия в сродстве компонентов смеси к неподвижной и подвижной фазам. Основными требованиями в методе является растворимость исследуемых веществ в подвижной фазе, а также свойство удерживаться неподвижной фазы. Если при вводе пробы какие-либо компоненты смеси окажутся нерастворимыми, они будут отфильтрованы и уже не участвуют в хроматографическом процессе. Точно также не будут разделяться компоненты, не удерживающиеся неподвижной фазой, т.к. они пройдут через колонку с подвижной фазой. Основными узлами хроматографа для ВЭЖХ являются: насос высокого давления для подачи подвижной фазы, устройство для ввода пробы (дозатор), хроматографическая колонка, детектор с регистрирующим устройством. Несмотря на некоторую общность узлов приборов с предыдущими вариантами хроматографии (ГХ и ГЖХ) здесь имеются отличия: - подвижная фаза подается под давлением (до 200-500 атм); - колонки иных размеров (обычно длиной 10-25 см, диаметр 4-5,5 мм, в микроколоночных хроматографах используют длиной 5-6 см и диаметром 1-2 мм); - размер частиц сорбента 5-10 мкм и их плотная упаковка в колонке, что обеспечивает эффективность разделения; -выбор сорбента ограничен; - другие температурные условия. В качестве сорбента в ВЭЖХ обычно используют силикагель с гидроксилированной поверхностью или привитыми к поверхности различными функциональными группами, например, алкилсиликагель, примером которого является Сепарон-18. К его поверхности привита алкильная группа с числом углеродных атомов 18. В колонках, содержащих силикагель с привитыми неполярными группами (Сепарон-18), используют полярные растворители – водные растворы, содержащие низшие спирты и ацетонитрил. Если в качестве сорбента используют силикагель, то элюентом служат углеводороды с добавлением небольшого количества спирта. В ВЭЖХ используются детекторы различных типов, их основные характеристики представлены в таблице 3. Таблица 3 Характеристики детекторов для ВЭЖХ
Принцип анализа в ВЭЖХ. Анализируемую смесь растворяют в подвижной фазе и с помощью дозатора или микрошприца вводят в специальное устройство прибора. Туда же подается под определенным давлением и с определенной скоростью подвижная фаза. По мере продвижения подвижной фазы с растворенными в ней веществами за определенный промежуток времени на колонке происходит разделение смеси. Чем больше сродство компонента к неподвижной фазе и чем меньше к подвижной, тем медленее он движется по колонке и тем дольше он в ней удерживается. Анализ проводится в определенном режиме температур, что создается с помощью устройства термостатирования. Сорбент, состав подвижной фазы, скорость подачи подвижной фазы, давление, температурный режим, объем вводимой пробы устанавливаются для данной конкретной пробы. Практическое применение ВЭЖХ используется в фармакопейном анализе при определении подлинности, испытании на чистоту и количественном определении лекарственных средств и их лекарственных форм. Достоинства метода ВЭЖХ: - универсальность; - высокая скорость процесса, позволяющая сократить анализ от нескольких часов до нескольких минут; - высокая чувствительность и селективность; - возможность анализа термолабильных веществ, каковыми являются многие лекарственные вещества; - минимальная степень размывания пиков, что дает возможность разделять соединения близкой химической структуры; - высокая степень механизации и автоматизации разделения и обработки полученной информации; - возможность использования в качестве подвижной фазы смеси растворителей, что позволяет варьировать ее элюирующую способность; - одновременное разделение и анализ компонентов исследуемой смеси. Таким образом, метод ВЭЖХ обладает такими преимуществами, которые позволили ему выдвинуться на передовые позиции как в отечественной практике, так и в развитых зарубежных странах. Данный метод включен во все ведущие фармакопеи мира. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
• •