Искусство
Языки
Языкознание
Вычислительная техника
Информатика
Финансы
Экономика
Биология
Сельское хозяйство
Психология
Ветеринария
Медицина
Юриспруденция
Право
Физика
История
Экология
Промышленность
Энергетика
Этика
Связь
Автоматика
Математика
Электротехника
Философия
Религия
Логика
Химия
Социология
Политология
Геология
Общая микробиология. Министерство здравоохранения РФ ярославская государственная медицинская академия
 Скачать 15.54 Mb.
|
Перечень конкретных учебно-целевых вопросов
ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ Серологический метод исследования. Методы оценки иммунного статуса организма человека. Иммуномодуляторы Иммуноферментный анализ (ИФА) обладает высокой чувствительностью и специфичностью, применяясь наиболее часто для определения антител. Известный антиген адсорбируется на поверхности лунок полистироловой пластины, в которые затем вносят двукратные разведения исследуемой сыворотки. Планшеты инкубируют при 370 С в течение 1 часа, отмывают и вносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (пероксидаза хрена). После инкубации в термостате при 370 в течение 1 часа планшет вновь промывают и во все лунки вносят пероксид водорода, а также индикатор – ортофенилендиамин. В случае положительной реакции пероксидаза в составе комплекса антиген-антитело вызовет разложение пероксида водорода с изменением цвета реакционной смеси со светло-желтого на красно-коричневый. Интенсивность окрашивания зависит от уровня антител в исследуемой сыворотке и может быть измерена на вертикальном спектрофотометре. ИФА сопровождается постановкой контролей с заведомо положительной и отрицательной эталонными сыворотками. Учет реакции осуществляется с помощью специального иммуноферментного анализатора – вертикального спектрофотометра (рис.40, см. приложение). Радиоиммунный анализ (РИА). Сущность РИА сходна с ИФА, однако сыворотку против иммуноглобулинов человека метят не ферментом, а радионуклидом (Н3- тритием, С14, I125, и т.д.). Результаты реакции учитывают с помощью β и γ анализаторов. Иммунофлюоресцентный метод (ИФМ). Антитела против антигенов вирусов и бактерий метят флюоресцирующим веществом (чаще всего изотиоцианатом флюоресцеина). Готовят микропрепараты на предметных стеклах из материала от больного (смыв из носоглотки, отделяемое бубона, мазки-отпечатки из трупного материала и т. д.) и обрабатывают их флюоресцирующей сывороткой. Если в микропрепаратах имеются антигены, соответствующие антителам флюоресцирующей сыворотки, то антитела соединяются с ними и образовавшиеся комплексы будут светиться при люминесцентной микроскопии. Эта модификация ИФМ называется прямой. При непрямом ИФМ микропрепарат обрабатывают сначала обычной сывороткой против определенного антигена, а затем - антиглобулиновой флюоресцирующей сывороткой. Метод иммунофлюоресценции широко применяется для диагностики различных инфекций, в частности, гриппа, острых респираторных вирусных заболеваний, сифилиса и т.д. Методы оценки иммунного статуса организма человека. А. Определение специфических антител к микробным антигенам, аутоантигенам, аллоантигенам, аллергенам. Б. Иммунохимические исследования: количественная и качественная оценка иммуноглобулинов, их фрагментов, иммунных комплексов в плазме и биологических жидкостях, определение цитокинов и растворимых рецепторов для цитокинов в плазме и биологических жидкостях, продуктов эффекторных клеток и воспалительных реакций, компонентов комплемента, белков острой фазы, других белков. В. Клеточные исследования. Определение субпопуляций лимфоцитов и фенотипических маркеров, характеризующих изменение функционального состояния клеток, клональности лимфоидных клеток, функциональной активности лимфоцитов invitro, пролиферативного ответа, продукции иммуноглобулинов, определение цитотоксичности лимфоцитов и других эффекторных клеток, оценка функциональной активности макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, базофилов, эозинофилов. Г. Иммуногистологические исследования. Д. Иммуногенетические исследования: HLA-типирование с помощью серологической и молекулярно-биологической технологии, фенотипическое и генотипическое определение аллотипов сывороточных белков, пренатальная диагностика и наследование генетически детерминированных дефектов иммунной системы. Набор методов для первичного скрининга иммунной системы (тесты 1-го уровня) включает определение популяций и субпопуляций лимфоцитов по кластерам дифференцировки (CD-3 – Т-лимфоциты, CD-4 – Т-хелперы, CD-8 – цитотоксические Т-киллеры/супрессоры, CD-16 – естественные киллеры, CD-19 – В-клетки и т.д.) методами цитофотометрии или иммунофлюоресцентного анализа, определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G с помощью метода радиальной иммунодиффузии по Манчини или нефелометрическими методами, уровня циркулирующих иммунных комплексов спектрофотометрическим методом, показателей фагоцитоза. Эти исследования позволяют выявить нарушения в основных звеньях иммунитета (гуморальном, клеточном, фагоцитарном). Уточняющие методы (тесты 2-го уровня), требующие специальной аппаратуры, реактивов и обученного персонала, позволяют оценить функции клеток иммунной системы, вспомогательных клеток, продукцию цитокинов и т.д. Для объективизации и стандартизации данных иммунологических исследований используется специальная аппаратура (иммуноферментные анализаторы, спектрофотометры и фотоэлектроколориметры, счетчики радиоактивности, лазерные нефелометры и проточные цитофлюориметры, хемилюминометры). В частности, определение количества лимфоцитов разных популяций и субпопуляций по поверхностным маркерам проводится с помощью автоматического подсчета клеток с использованием специального прибора - проточного цитофлюориметра (рис. 41, см. приложение). Для этого образец цельной крови инкубируют с моноклональными антителами, меченными флюоресцентным красителем, пропускают через тонкую трубочку, на выходе из которой формируется струя из капель, содержащих только одну клетку, проходящую перед лазерным лучом. При попадании лазерного луча в клетку происходит его отклонение, а также свечение поверхностного антигена клетки в результате его соединения с соответствующим флюоресцирующим моноклональным антителом. Фотоумножитель проточного цитофлюориметра регистрирует оба сигнала, при этом светорассеяние дает информацию о размерах и гранулярности клетки, а флюоресценция - о количестве связанных клеткой меченых антител, позволяя судить об экспрессии поверхностных маркеров. При использования двух разных моноклональных антител, конъюгированных с разными флюорохромами (например, флюоресцеина, дающего зеленое свечение, и фикоэритрина, обладающего красным свечением), клетки оцениваются по интенсивности зеленого и красного типов флюоресценции. Оценка иммунного статуса организма человека при различных патологических состояниях имеет важное практическое значение для диагностики, лечения, прогнозирования, оценки эффективности проводимой терапии при многих заболеваниях. Иммунограмма здорового человека представлена в таблице 11. Иммунотропные препараты для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями иммунной системы, подразделяются на следующие группы:
Классификация и краткая характеристика иммунотропных препаратов представлена в таблицах 12,13. Таблица 11 . Иммунограмма здорового человека
Таблица 12. Классификация иммунотропных препаратов
Таблица 13. Иммунодепрессанты.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ 1. Иммуноферментный анализ (ИФА - демонстрация). Антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) адсорбированы на дне лунок полистироловой пластины. В лунки внесены исследуемые образцы сывороток крови. Контроли: 1 - эталонная сыворотка с антителами против ВИЧ (положительный контроль), 2 - сыворотка, не содержащая антител ВИЧ (отрицательный контроль). Реакция проходит при 370 С в течение I часа. После отмывки во все лунки вносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченую ферментом (пероксидаза хрена), выдерживают 1 час при 370, после чего вновь отмывают. Во все лунки вносят перекись водорода, которая расщепляется пероксидазой и индикатор (ортофенилендиамин), изменяющий свой цвет в результате химической реакции. Учет реакции производят на специальном (вертикальном) спектрофотометре. Положительный контроль характеризуется окрашиванием среды в лунке в красно-коричневый цвет, так как в эталонной сыворотке содержались антитела к ВИЧ, вступившие в реакцию с антигенами, адсорбированными на дне лунки пластины. При добавлении меченой пероксидазой сыворотки против иммуноглобулинов человека антитела меченой сыворотки соединяются с антителами эталонной сыворотки и после второй отмывки также остаются в лунке. Поэтому в лунке контроля 1 произошла выраженная химическая реакция. Контроль 2 - бесцветный, так как в сыворотке, внесенной в эту лунку, не содержались антитела к ВИЧ- вирусу, поэтому в этой лунке не произошло цветной реакции с сывороткой против иммуноглобулинов человека, меченой пероксидазой. Интенсивность окраски в опытной лунке зависит от уровня антител к ВИЧ в исследуемой сыворотке, 2. Радиоиммунный анализ (РИА - демонстрация). Сущность РИА сходна с ИФА, однако сыворотку против иммуноглобулинов человека метят не ферментом, а радиоактивным изотопом (Н3- тритием, С14, I125, и т.д.). Результаты реакции учитывают с помощью д. и д. анализаторов. Студенты знакомятся с оборудованием для РИА. 3. Иммунофлюоресцентный метод (ИФМ - демонстрация). Антитела против антигенов вирусов и бактерий за счет ковалентных связей метят флюоресцирующим веществом (чаще всего изотиоцианатом флюоресцеина). Готовят микропрепараты на предметных стеклах из материала от больного (смыв из носоглотки, отделяемое бубона, мазки-отпечатки из трупного материала и т. д.) и обрабатывают их флюоресцирующей сывороткой. Если в микропрепаратах имеются антигены соответствующие антителам флюоресцирующей сыворотки, то антитела соединяются с ними и при люминесцентной микроскопии образовавшиеся комплексы будут светиться. Эта модификация ИФМ называется прямой. При непрямом ИФМ микропрепарат обрабатывают сначала обычной сывороткой против определенного антигена, а затем - антиглобулиновой флюоресцирующей сывороткой. Метод иммунофлюоресценции широко применяется для диагностики различных инфекций, в частности, гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний. Студенты микроскопируют и зарисовывают клетки цилиндрического эпителия носоглотки человека, пораженные вирусом гриппа (прямой метод иммунофлюоресценции). Знакомство с методами оценки иммунного статуса организма человека (ВОЗ, 1993). А. Определение специфических антител к микробным антигенам, аутоантигенам, аллоантигенам, аллергенам. Б. Иммунохимические исследования: количественная и качественная оценка иммуноглобулинов, их фрагментов, иммунных комплексов в плазме и биологических жидкостях, определение цитокинов и растворимых рецепторов для цитокинов в плазме и биологических жидкостях, продуктов эффекторных клеток и воспалительных реакций, компонентов комплемента, белков острой фазы, других белков. В. Клеточные исследования. Определение субпопуляций лимфоцитов и фенотипических маркеров, характеризующих изменение функционального состояния клеток, клональности лимфоидных клеток, функциональной активности лимфоцитов ин витро, пролиферативного ответа, продукции иммуноглобулинов, определение цитотоксичности лимфоцитов и других эффекторных клеток, оценка функциональной активности макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, базофилов, эозинофилов. Г. Иммуногистологические исследования. Д. Иммуногенетические исследования: HLA-типирование с помощью серологической и молекулярно-биологической технологии, фенотипическое и генотипическое определение аллотипов сывороточных белков, пренатальная диагностика и наследование генетически детерминированных дефектов иммунной системы. В реальной практике для оценки иммунного статуса выполняется первичный скрининг иммунной системы и постановка тестов для уточнения характера иммунных нарушений. Набор методов для первичного скрининга иммунной системы (тесты 1-го уровня) обычно включает определение популяций и субпопуляций лимфоцитов по кластерам дифференцировки (CD-3 – Т-лимфоциты, CD-4 – Т-хелперы, CD-8 – цитотоксические Т-киллеры/супрессоры, CD-16 – естественные киллеры, CD-19 – В-клетки и т.д.) методами цитофотометрии или иммунофлюоресцентного анализа, определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G с помощью метода радиальной иммунодиффузии по Манчини или нефелометрическими методами, уровня циркулирующих иммунных комплексов спектрофотометрическим методом, показателей фагоцитоза. Эти исследования позволяют выявить нарушения в основных звеньях иммунитета (гуморальном, клеточном, фагоцитарном). Уточняющие методы (тесты 2-го уровня), требующие специальной аппаратуры, реактивов и обученного персонала, позволяют оценить функции клеток иммунной системы, вспомогательных клеток, продукцию цитокинов и т.д. Для объективизации и стандартизации данных иммунологических исследований используется специальная аппаратура (иммуноферментные анализаторы, спектрофотометры и фотоэлектроколориметры, счетчики радиоактивности, лазерные нефелометры и проточные цитофлюориметры, хемилюминометры). Преимущества иммунологических методов заключаются в том, что эти методы весьма чувствительны и специфичны. Студенты знакомятся с основными методами оценки иммунного статуса организма человека в демонстрации. 1. Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов с помощью иммунофлюоресцентного метода (демонстрация). Лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови центрифугированием на градиенте фиколл-верографина (плотность 1,077 г/мл). 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в центрифужные пробирки или лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD-3 – Т-лимфоциты, CD-4 – Т-хелперы, CD-8 – цитотоксические Т-киллеры/супрессоры, CD-19 – В-клетки) и инкубируют 30-45 мин при +40 С. Затем клетки дважды отмывают на центрифуге при 1200 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляют. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab')2 -фрагментов овечьих антител к Ig мыши в разведении 1:100, меченых флюоресцеином. Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +40 С. После этого клетки 2 раза отмывают на центрифуге, добавляют 50 мкл 1% параформальдегида (или формалина в разведении 1:40), суспендируют и анализируют на проточном цитофлюориметре или просматривают с помощью флуоресцентного микроскопа, определяя процент флуоресцирующих клеток. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, однако вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса или нормальным Ig мыши. Определение количества лимфоцитов разных популяций и субпопуляций по поверхностным маркерам проводится также с помощью автоматического подсчета клеток с использованием специального прибора - проточного цитофлюориметра. Для этого образец цельной крови инкубируют с моноклональными антителами, меченными флюоресцентным красителем, пропускают через тонкую трубочку, на выходе из которой формируется струя из капель, содержащих только одну клетку, проходящую перед лазерным лучом. При попадании лазерного луча в клетку происходит его отклонение, а также свечение поверхностного антигена клетки в результате его соединения с соответствующим флюоресцирующим моноклональным антителом. Фотоумножитель проточного цитофлюориметра регистрирует оба сигнала, при этом светорассеяние дает информацию о размерах и гранулярности клетки, а флюоресценция - о количестве связанных клеткой меченых антител, позволяя судить об экспрессии поверхностных маркеров. При использования двух разных моноклональных антител, конъюгированных с разными флюорохромами (например, флюоресцеина, дающего зеленое свечение, и фикоэритрина, обладающего красным свечением), клетки оцениваются по интенсивности зеленого и красного типов флюоресценции. 2. Методы оценки функций лимфоцитов (демонстрация). Функциональную полноценность Т-лимфоцитов косвенно оценивают с помощью кожных проб, отражающих интенсивность реакций ГЗТ в отношении распространенных микробных аллергенов (кандидозного, стрептококковых, туберкулина и т.д.). Аллерген вводят внутрикожно и через 48 ч измеряют диаметр инфильтрата — уплотнения, отражающего интенсивность реакции ГЗТ. Одной из функций лимфоцитов является их пролиферация в ответ на действие антигенов – индукторов пролиферации - так называемых неспецифических поликлональных митогенов. Для Т-лимфоцитов распространенным поликлональными митогенами является фитогемагглютинин, полученный из бобов растений), для В-лимфоцитов — компоненты бактерий (липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий, А-протеин стафилококка и т.д.). Для количественной оценки пролиферации клеток обычно исследуют включение радиоактивной метки (Н3-тимидина) в ДНК клеток как показатель их пролиферации. Этот тест пролиферативной активности лимфоцитов называется реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Другой подход к оценке функций Т-лимфоцитов заключается в измерении их способности продуцировать цитокины, появляющиеся при активации Т-лимфоцитов антигенами (митогенами). Определение типов цитокинов и их количества в культуральной среде Т-лимфоцитов позволяет оценить функциональную активность клеток. Количество цитокинов определяют по их биологической активности или с помощью ИФА. Функции В-лимфоцитов косвенно оценивают по уровням иммуноглобулинов, изогемагглютининов и нормальных антибактериальных антител в сыворотке крови. Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ – демонстрация). Реакция основана на способности лимфоцитов после повторного контакта с антигеном, к которому они были ранее сенсибилизированы, продуцировать лимфокины, влияющих на миграцию гранулоцитов, моноцитов, макрофагов. РТМЛ периферической крови в присутствии причинного антигена позволяет выявить специфическую сенсибилизацию Т-лимфоцитов. РТМЛ ставят в капиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейкоцитов крови в присутствии и в отсутствие причинного микробного антигена, после чего измеряют зоны миграции (в процентах) в присутствии антигена по сравнению с контролем, принятым за 100 %. В случае выявления сенсибилизации к антигену наблюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже 100 %). 2. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови человека методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (демонстрация). В 3 пробирки с расплавленным и остуженным до 500 С агаром вносят соответственно сыворотки против иммуноглобулинов человека классов М, А, G. Содержимое пробирок разливают на 3 стеклянных или пластиковых пластины. После застывания агара в нем на расстоянии 1 см друг от друга вырезают лунки. В лунки вносятся исследуемые и эталонные сыворотки с известным содержанием иммуноглобулинов. Иммуноглобулины исследуемых сывороток диффундируют в агар и образуют зону преципитации вокруг лунки, взаимодействуя с антителами, находящимися в агаре. Измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки и сравнивают с диаметром кольца преципитации эталонной сыворотки. Используя калибровочную кривую или специальную компьютерную программу, определяют уровень иммуноглобулинов в сыворотке в г/л. 3. Оценка фагоцитарного звена иммунитета (демонстрация). Цитратную кровь или лейкоцитарную взвесь инкубируют с бактериями или другими объектами (частицы латекса, дрожжи и т.д.) в течение 30 минут, после чего готовят мазок, окрашивают по методу Романовского-Гимза и микроскопируют. Подсчитывают 100 клеток для определения процента фагоцитирующих клеток (в норме 40-80%) и количества бактерий захваченных 1 фагоцитирующей клеткой (в норме – 1-5). Кроме того оценивают интенсивность окислительного взрыва в фагоцитах (косвенный показатель бактерицидности) по способности восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме фагоцитов глыбок темно-синего формазана. Чем активнее окислительный взрыв в фагоцитах, тем большая доля клеток содержит осадок формазана. После подсчета клеток доля формазан-положительных выражается в процентах. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц только с красителем без индуктора окислительного взрыва доля формазан-положительных клеток не превышает 1—2 %. Инкубация лейкоцитов здоровых лиц с индуктором окислительного взрыва (объекты фагоцитоза, бактериальные полисахариды) приводит к окислительному взрыву всех 100 % фагоцитов и накоплением осадка формазана. Снижение доли формазан-положительных клеток свидетельствует о дефектности кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов. 2. Титрование комплемента сыворотки крови (демонстрация). Метод основан на феномене комплементзависимого лизиса нагруженных антителами эритроцитов барана. За единицу активности комплемента принимается такое его количество, которое вызывает гемолиз 50 % сенсибилизированных эритроцитов (СН50). В пробирку с сывороткой крови в разведении 1:10 добавляют гемолитическую систему (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой кролика), инкубируют 45 минут при 370 С, сохранившиеся эритроциты осаждают центрифугированием. Интенсивность гемолиза регистрируют с помощью спектрофотометра или фотоэлектроколориметра. У здоровых людей титр комплемента составляет 40—80 СН50 на 1 мл. Титрование комплемента по 50 % гемолизу не позволяет судить о состоянии отдельных компонентов системы комплемента. В настоящее время выпускаются иммуноферментные тест-системы для определения отдельных компонентов системы комплемента. В последние годы налажен выпуск иммуноферментных систем для определения различных цитокинов. Исследование уровня цитокинов при различных патологических состояниях дает ценную информацию для диагностики ряда болезней и назначения обоснованного лечения. Оценка иммунного статуса организма человека при различных патологических состояниях имеет важное практическое значение для диагностики, лечения, прогнозирования, оценки эффективности проводимой терапии при многих заболеваниях. Показатели иммунограммы здорового человека представлены в таблице 12. Таблица 12 Показатели иммунограммы здорового человека
Примечание: ХЛ- хемилюминесценция нейтрофилов (спонтанная, стимулированная) Педиатрические аспекты темы Обратить внимание на широкое использование методов иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа для диагностики детских инфекционных заболеваний. Тема 16. УЧЕНИЕ ОБ ИММУНИТЕТЕ. СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ БИОПРЕПАРАТЫ. АЛЛЕРГЕНЫ |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||