- ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ Реакции иммунитета и их практическое применение для диагностики инфекционных заболеваний.
- САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ 1. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК
- 3. Учет реакции преципитации в геле
- 4. Иммуноэлектрофорез (демонстрация).
- 5. Реакция нейтрализации токсина антитоксином при ботулизме (демонстрация).
- 6. Учет реакции Кумбса (демонстрация).
- 7. Реакция флоккуляции (демонстрация).
- 8. Антистрептолизиновая реакция (демонстрация).
- Тема 15. УЧЕНИЕ ОБ ИММУНИТЕТЕ. КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ. ИММУННЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА И МЕТОДЫ ЕГО ОЦЕНКИ. СОВРЕМЕННЫЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Общая микробиология. Министерство здравоохранения РФ ярославская государственная медицинская академия
 Скачать 15.54 Mb.
|
Перечень конкретных учебно-целевых вопросов
ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ Реакции иммунитета и их практическое применение для диагностики инфекционных заболеваний. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным реакциям, т.к. в ней участвует комплемент и две специфические системы антиген-антитело. Первая система стоит из антигена и антитела, вторая (индикаторная) – из эритроцитов барана и соответствующей им гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, реагируя с эритроцитами, делает их чувствительными (сенсибилизирует) к действию комплемента, в присутствии которого эритроциты разрушаются (лизируются). РСК протекает в две фазы. В первой (специфической) взаимодействуют антиген, антитело и комплемент. Если антиген соответствует антителу, они соединяются и образуют комплекс, который связывает комплемент. Образовавшийся комплекс визуально не определяется и выявляется индикаторной гемолитической системой, участвующей во второй (индикаторной) фазе реакции. Если после добавления индикаторной системы гемолиза эритроцитов не наступает, комплемент связан первой системой и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу. Поэтому отсутствие гемолиза оценивается как положительный результат РСК (рис. 38, см. приложение). Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным, вызывая гемолиз эритроцитов. Таким образом, наличие гемолиза свидетельствует об отрицательном результате РСК. РСК, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, нашла широкое применение в серодиагностике ряда инфекционных болезней и идентификации антигенов. Реакция применяется при диагностике сифилиса, других спирохетозов, риккетсиозов, вирусных и других инфекций. Реакция нейтрализации используется при определении активности микробных (или другого происхождения) экзотоксинов. Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие токсина. Существуют 2 варианта постановки реакции: in vivo и in vitro. Первый вариант заключается в том, что готовят последовательные разведения антитоксической сыворотки, затем к каждому разведению добавляют определенную дозу токсина, смесь выдерживают 2 часа при температуре 370 С, после чего вводят чувствительным животным. При нейтрализации токсина антитоксином животные не погибают. Второй вариант реакции основан на феномене нейтрализации действия микробного токсина (например, гемолитического - 0-стрептолизина патогенного стрептококка) антитоксическими антителами иммунной сыворотки в пробирке. Отсутствие гемолиза свидетельствует о наличии антитоксических антител. Другим вариантом реакции нейтрализации in vitro является флоккуляция, при которой при взаимодействии токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя (инициальная) флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях. Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекционных болезней (сибирской язвы, менингококковой и пневмококковой инфекций, дизентерии). В судебно-медицинской практике ее используют для определения видовой принадлежности крови и т. д.; при проведении санитарно-гигиенических исследований для установления фальсификации продуктов. Эта реакция служит также для определения филогенетического родства животных, растений и микроорганизмов. В качестве антигена используют полноценные белковые, а также гаптены (полисахаридные, липо-полисахаридные, гликопротеидные) антигены микроорганизмов или высших организмов. Иммунную преципитирующую сыворотку, содержащую антитела, применяют неразведенной или в небольшом разведении (1:5-1:10). Основными методами реакции являются кольцепреципитация и реакция преципитации в геле. Реакцию кольцепреципитации ставят в специальных преципитационных пробирках (диаметр 0,4-0,5 см, высота 7—8 см). В пробирку вносят 0,2 мл иммунной сыворотки, на которую осторожно наслаивают такой же объем антигена. Параллельно в том же объеме ставят контроли с заведомо положительной и отрицательной сыворотками, контроль антигена (антиген в изотоническом растворе хлорида натрия), контроль сыворотки (исследуемая сыворотка в изотоническом растворе хлорида натрия). Реакцию учитывают после 5-30 минутной инкубации в термостате при 370С. Положительный результат характеризуется появлением белого кольца (преципитата) на границе антигена и антитела. Реакция преципитации в геле (агаровом, крахмальном, полиакриламидном) позволяет четко разграничить преципитаты, образованные различными системами антиген-антитело, в разных участках геля. Метод широко используется для определения токсигенности дифтерийных бактерий, определения иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови человека и т.д. Иммуноэлектрофорез основан на принципе сочетания электрофореза и реакции преципитации в геле. С помощью этого метода анализируют различные антигены микробов и вирусов, антитела, сыворотку крови человека, ликвор и т.д. Исследуемый материал вносят в лунку, расположенную в геле на стеклянной пластине и разделяют его фракции электрофорезом. Затем в траншею, вырезанную в геле параллельно линии электрофоретической миграции белков, вносят сыворотки против антигенов, которые хотят обнаружить (например, против антигенов менингококка). Антитела сыворотки диффундируют в агар и в местах встречи с соответствующими антигенами образуют зоны преципитации в виде дуги. Определение неполных антител (реакция Кумбса). Эта реакция позволяет выявить неполные (одновалентные) антитела, которые при соединении с эритроцитами, бактериями и риккетсиями не дают видимых эффектов реакции антиген-антитело, появляясь в крови больных в более ранние сроки и в более высоких титрах, чем полные. Прибавление кроличьей сыворотки против глобулинов человека приводит к агглютинации, т.к. антитела этой сыворотки бивалентны и взаимодействуют с неполными антителами, связанными с поверхностными антигенами бактерий или эритроцитов, с образованием видимого осадка в виде зонтика. САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ 1. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК). Реакцию ставят в соответствии с таблицей 11. РСК протекает в две фазы. В первой фазе реакции участвуют антиген, антитело, комплемент. При соответствии антигена антителу образуется комплекс, связывающий комплемент. При отсутствии соответствия антигена и антитела комплемент остается свободным. Вторая фаза реакции (индикаторная) выявляет связывание комплемента и происходит между комплементом и реагентами гемолитической системы (смесь взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки). Если комплемент связан в первой фазе реакции, гемолиза эритроцитов под действием гемолизинов не происходит ( задержка гемолиза - реакция положительна); если комплемент свободен, наблюдается гемолиз (реакция отрицательна). 2. Постановка и учет реакции кольцепреципитации по Асколи. Реакция Асколи используется для выявления термостабильного антигена возбудителя сибирской язвы в материале (кожа, шерсть), подозрительном на загрязнение данными микробами. Техника постановки реакции: в преципитационную пробирку наливают цельную преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в количестве 0,5 мл. Пастеровской пипеткой наслаивают по стенке пробирки 0,5 мл исследуемого антигена. Антиген готовят путем кипячения материала в растворе кислоты. В контрольную пробирку добавляют вместо антигена физиологический раствор. В случае положительного результата на границе антигена и сыворотки образуется преципитат в виде кольца. 3. Учет реакции преципитации в геле для определения токсигенности дифтерийных бактерий (демонстрация). Чашку Петри заливают питательным агаром, на дно чашки накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной противодифтерийной антитоксической сывороткой. Перпендикулярно полоске бумаги засевают исследуемую Таблица 11 Схема постановки реакции связывания комплемента
Обозначения: КПС – контроль положительной сыворотки, КОС – контроль отрицательной сыворотки, КА- контроль антигена, КК – контроль комплемента, КГС – контроль гемолитической системы
4. Иммуноэлектрофорез (демонстрация). С помощью иммуноэлектрофореза анализируют различные антигены микробов и вирусов, антитела, сыворотку крови человека, ликвор и т.д. Исследуемый материал вносят в лунку, расположенную в геле на стеклянной пластине и разделяют его фракции электрофорезом. Затем в лунку, вырезанную в геле параллельно линии электрофоретической миграции белков, вносят сыворотки против антигенов, которые хотят обнаружить (например, против антигенов менингококка). Антитела сыворотки диффундируют в агар и в местах встречи с соответствующими антигенами образуют зоны преципитации в виде дуги. 5. Реакция нейтрализации токсина антитоксином при ботулизме (демонстрация). Реакцию ставят с фильтратом, полученным из консервов домашнего приготовления (например, из грибов), послуживших причиной отравления больного. К фильтрату добавляют поливалентную противоботулиническую сыворотку в разведении 1:40. Смесь выдерживают 2 часа при температуре 370 С, вводят мыши внутрибрюшинно в объеме 0, 5 мл. Контрольной мыши вводят 0,5 мл фильтрата. Если токсин, содержащийся в фильтрате, соответствует сыворотке, то произойдет нейтрализация токсина и мышь не погибнет. Контрольная мышь погибает с явлениями параличей. 6. Учет реакции Кумбса (демонстрация). Реакция Кумбса позволяет выявить неполные (одновалентные) антитела, которые при соединении с эритроцитами, бактериями и риккетсиями не дают видимых эффектов реакции антиген-антитело. Прибавление кроличьей сыворотки против глобулинов человека приводит к агглютинации, т.к. антитела этой сыворотки бивалентны и взаимодействуют с неполными антителами, связанными с бактериями или эритроцитами, с образованием осадка. Реакция Кумбса при бруцеллезе ставится в тех случаях, когда титр классического варианта реакции агглютинации меньше диагностического ( 1:100). Добавление в пробирки с отрицательными результатами антиглобулиновой сыворотки приводит к увеличению титра антител. Это связано с тем, что неполные антитела появляются в крови больных в более ранние сроки и в более высоких титрах, чем полные. 7. Реакция флоккуляции (демонстрация). В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя (инициальная) флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях. Реакцию ставят в два этапа. Сначала по стандартной сыворотке устанавливают пороговую величину флоккуляции Lf(Limes flocculationis) в 1 мл токсина. Lf токсина определяется его минимальным количеством, которое дает инициальную флоккуляцию с 1 международной единицей (ME) сыворотки. Затем известной силы токсин и испытуемую антитоксическую сыворотку разливают в пробирки в определенном объеме, выдерживают в водяной бане при температуре 45 °С в течение 30 мин до выпадения хлопьев в одной из них. Инициальная флоккуляция проявляется в той пробирке, где количество токсина соответствует количеству международных единиц сыворотки. Если флоккуляция произошла в 3-й пробирке, в 0,4 мл сыворотки находится 40 ME. Следовательно, 1 мл сыворотки содержит 40:0,4=100 ME. 8. Антистрептолизиновая реакция (демонстрация). Реакция основана на феномене нейтрализации гемолитического действия микробного токсина (0-стрептолизина) антитоксическими антителами иммунной сыворотки. Для постановки реакции предварительно определяют минимальную гемолитическую дозу токсина (0-стрептолизина), т.е. наименьшее его количество, которое вызывает гемолиз 0,2 мл 5% взвеси эритроцитов кролика. Затем определяют рабочую дозу 0-стрептолизина, т.е. наибольшее количество токсина, которое в смеси с 1 АЕ (антитоксической единицы) стандартной антитоксической сыворотки полностью нейтрализуется и не вызывает гемолиза эритроцитов. Для постановки основного опыта готовят разведения исследуемой сыворотки, к каждому из которых добавляют рабочую дозу токсина, инкубируют 45 мин при 370 С, затем вносят равный объем взвеси эритроцитов и инкубируют 1 час при 370 С и 18 часов при комнатной температуре. Обязательным является контроль на возможность спонтанного гемолиза эритроцитов. Положительная реакция характеризуется отсутствием гемолиза в результате нейтрализации стрептолизина (гемолизина) соответствующими антителами. Студенты производят учет демонстрационной реакции. 9. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА - демонстрация) основана на взаимодействии вирусных антигенов (гемагглютининов) со специфическими антителами, в результате чего происходит блокада (торможение) гемагглютинирующей активности вируса. Развернутую РТГА ставят в лунках полистироловых пластин. Предварительно определяют титр вирусного антигена в реакции гемагглютинации для подбора рабочей дозы. В лунках готовят 2-кратные разведения исследуемой сыворотки, добавляют равный объем взвеси вируса в рабочем разведении и инкубируют 2 ч при температуре 370 С. Затем добавляют 1 % взвеси куриных эритроцитов, инкубируют 2 ч и оценивают результат по феномену торможения гемагглютинации. Положительная РТГА характеризуется образованием плотного осадка эритроцитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА. Произвести учет демонстрационной РТГА. Педиатрические аспекты темы
Тема 15. УЧЕНИЕ ОБ ИММУНИТЕТЕ. КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ. ИММУННЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА И МЕТОДЫ ЕГО ОЦЕНКИ. СОВРЕМЕННЫЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
