рабочая тетрадь ФГОС 3. Петрозаводский государственный университет биологическая химия
 Скачать 1.54 Mb.
|
|
РАЗДЕЛ 4. ХИМИЯ И ОБМЕН УГЛЕВОДОВ РАБОТА 9. ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Цель работы: ознакомиться с современным энзиматическим мето-дом количественного определения глюкозы в биоло-гических жидкостях, который широко применяется в клинической практике. Задачи:
Принцип метода. Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества пероксида водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, окрашенный в розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.  Ход работы. В три обычные химические пробирки наливают:
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 10 минут при 37°С. После окончания инкубации измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-510 нм (на ФЭКе). Окраска стабильна в течение часа после окончания инкубации при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей. Примечание. Количество глюкозы в моче определяют только при положительной качественной реакции на глюкозу. Реакция считается положительной, если смесь из 0,01 мл исследуемой мочи и 0,5 мл рабочего реагента через 15 минут приобретает розовую окраску. Результаты: расчёт концентрации глюкозы проводят по формуле: С = Ео/Ест × 10, где Ео – оптическая плотность опыта, Ест – оптическая плотность стандарта, 10 – концентрация стандартного раствора глюкозы в моль/л. Нормальное содержание глюкозы, определённое этим методом, в сыворотке или плазме крови здорового человека составляет 4,2-6,1 ммоль/л, в моче – <0,8 ммоль/л. Выводы: РАБОТА 10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОЛЕРАНТНОСТИ К САХАРНОЙ НАГРУЗКЕ Цель работы: ознакомиться с методом диагностики I и II типа сахарного диабета, принципами изучения толерант-ности к сахарной нагрузке. Задачи:
Изучение реакции организма на однократную нагрузку глюкозой представляет большой клинический интерес. У здорового человека одноразовый приём 50-100 г глюкозы вызывает временное повышение сахара в крови – пищевую, или алиментарную, гипергликемию. Однократная проба с сахарной нагрузкой заключается в следующем. Утром натощак у обследуемого определяют содержание сахара в крови, после чего ему дают per os глюкозу (1 г на 1 кг веса) или сахарозу (1,5 г на 1 кг веса) с небольшим количеством воды. Повторно определяют концентрацию глюкозы в крови через каждые 15 минут в течение первого часа после приёма сахара и через каждые 30 минут – последующие три часа. Полученные результаты отражают графически и получают сахарную кривую. При анализе сахарной кривой обращают внимание на начальное содержание сахара, быстроту и высоту подъёма, продолжительность гиперглюкоземии и характер её снижения. У здоровых людей уже через 15 минут после приёма глюкозы концентрация её в крови повышается и достигает максимума между 30 и 60 минутами. Этот максимум обычно не превышает почечный порог и не приводит к глюкозурии. Затем уровень глюкозы в крови снижается и к 120-й минуте возвращается к исходному, а иногда бывает ниже его вследствие избыточного выделения инсулина поджелудочной железой. Через три часа содержание глюкозы в крови возвращается к исходному уровню. Гликемические кривые отличаются от нормы при сахарном диабете, повреждении паренхимы печени (при гипатитах, циррозе), гипо- и гипертиреозе, болезни Аддисона, тяжёлых анемиях, заболеваниях центральной нервной системы, инфекционных болезнях, токсических состояниях. Ход работы. У испытуемого (добровольца) натощак берут из пальца 0,1 мл крови и определяют в ней количество глюкозы глюкозооксидазным методом (см. работу 13). После взятия крови испытуемому дают съесть сахарозу в течение не более 5 минут. Сахар можно запивать небольшим количеством воды. Затем у испытуемого берут кровь из пальца через 30, 60, 90 и 120 минут после приёма сахара и определяют в ней содержание глюкозы глюкозооксидазным методом (см. работу 13). Результаты:
Сахарная кривая Выводы: РАЗДЕЛ 5. ХИМИЯ И ОБМЕН ЛИПИДОВ РАБОТА 11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРОЛА В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ЭНЗИМАТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Цель работы: ознакомиться с одним из самых распространенных в клинической биохимии методов определения холестерола. Задачи:
Принцип метода. При гидролизе эфиров холестеридов холестеролэстеразой образуется холестерол. Общий холестерол (свободный и этерифицированный) окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:  В присутствии пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, имеющий розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерола. Ход работы. В две обычные химические пробирки наливают:
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37°С. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля (кювета с рабочим реагентом) в кюветах с рабочей длиной 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-500 нм. Окраска проб стабильна в течение 2 часов при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей. Результаты: расчёт количества общего холестерола проводят по формуле: С = Ео/Ест × 5,17 (ммоль/л) или С = Ео/Ест × 200 (мг/100мл), где Ео – экстинкция опытной пробы, Ест – экстинкция стандарта. Содержание холестерола в сыворотке крови здоровых людей разного возраста колеблется в пределах: 20-29 лет – 3,72-7,11 ммоль/л (144-175 мг/дл), 30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг/дл), 40-49 лет – 4,40-8,15 ммоль/л (170-315 мг/дл), старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг/дл). Выводы: РАБОТА 12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Цель работы: ознакомиться с современным и самым распростра-нённым в клинической биохимии методом определе-ния α-холестерола в сыворотке крови. Задачи:
Принцип метода. Хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) осаждаются фосфорновольфрамовой кислотой и Mg2+ и отделяются центрифугированием. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) остаются в надосадочной жидкости (супернатанте) и количество холестерола в них определяется так же, как концентрация общего холестерола, энзиматическим методом. Ход работы а) Осаждение ЛПОНП и ЛПНП В три центрифужные пробирки наливают:
Во все пробирки добавляют по 0,3 мл осаждающего реагента. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем опытную пробу центрифугируют в течение 15 минут при 3000 оборотах в минуту и прозрачный центрифугат используют для определения холестерола ЛПВП (α-холестерола). Стандартную и контрольную пробы можно не центрифугировать. б) Определение концентрации α-холестерола В три обычные химические пробирки (опытную, стандартную и контрольную) аккуратно автоматической пипеткой переносят по 0,2 мл жидкости из соответствующих центрифужных пробирок и добавляют по 2,0 мл рабочего реагента. Реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37°С. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм при длине волны 490-500 нм. Результаты:
С = Ео/Ест × 1,29 (ммоль/л) или С = Ео/Ест × 50 (мг/дл), где Ео и Ест – экстинкции опытной и стандартной проб.
ХИА = (общий холестерол – α-холестерол) / α-холестерол В норме величина холестеринового индекса атерогенности ≤3,0. Выводы: РАЗДЕЛ 6. ОБМЕН ПРОСТЫХ БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ РАБОТА 13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МОЧЕВИНЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ ДИАЦЕТИЛМОНООКСИМОВЫМ МЕТОДОМ Цель работы: ознакомиться с одним из методов определения концентрации мочевины в крови и моче, который широко используется в диагностике для оценки тяжести патологического процесса, для наблюдения за течением заболевания и оценки эффективности проводимого лечения, а также оценки состояния выделительной функции почек. Задачи:
Мочевина является одним из основных конечных продуктов белкового обмена. Азот мочевины составляет около 50% остаточного азота крови. Количество мочевины в сыворотке крови в норме составляет 2,49-8,33 ммоль/л (20-50 мг/дл). Содержание мочевины в крови возрастает при любых патологических состояниях. Однако наиболее важное диагностическое значение имеет увеличение количества мочевины при заболеваниях почек (в 2-10 раз). Уменьшение количества мочевины в крови наблюдается при болезнях печени (цирроз, гепатиты). Количество мочевины, выделяемое из организма, свидетельствует об интенсивности белкового обмена. При употреблении пищи, богатой белками, а также при усиленной мышечной работе содержание мочевины в моче увеличивается, а при безбелковой диете – снижается. Количество мочевины в суточной моче подвержено возрастным изменениям и составляет: у новорожденных – следы; 1-3-месячных – 0,7-1,4 г/сутки; 4-6-месячных – 1,0-3,3 г/сутки; 7-9-месячных – 3,8-5,7 г/сутки; 2-5-летних – 5-11 г/сутки; 14-летних – 20 г/cутки; у взрослых – 20-35 г/сутки (333-582 ммоль/сутки). Определение количества мочевины в моче представляет клинический интерес. Увеличение содержания мочевины наблюдается при лихорадочных состояниях, сахарном диабете. Количество мочевины в моче резко снижается при почечной недостаточности, патологиях печени (цирроз, дистрофия, гепатиты), а также при общем и белковом голодании. Принцип метода. Мочевина взаимодействует с диацетилмоноокси-мом в присутствии тиосемикарбазида и трёхвалентного железа в кислой среде при нагревании с образованием комплексного соедине-ния розово-красного цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины.  
Ход работы. В три пробирки вносят автоматической пипеткой:
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента и содержимое перемешивают. Пробирки накрывают кусочками фольги, помещают в бурно кипящую водяную баню на 10 минут, после чего охлаждают под струёй проточной воды. Затем опыт и стандарт колориметрируют против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм с зелёным светофильтром (длина волны 540 нм). Окраска растворов стабильна около 15 минут после снятия проб из бани. Результаты: количество мочевины в сыворотке крови рассчитывают по формуле: С = (Еоп × Сст) / Ест, где С – количество мочевины в сыворотке крови (ммоль/л); Сст – концентрация стандартного раствора мочевины (8,33 ммоль/л); Еоп – оптическая плотность опытной пробы; Ест – оптическая плотность стандартной пробы.
Ход работы. Мочу перед анализом разбавляют дистиллированной водой в 25 раз (к 1 мл мочи добавляют 24 мл Н2О). В три пробирки вносят автоматической пипеткой:
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, перемешивают, накрывают кусочками фольги и помещают в бурно кипящую водяную баню на 10 минут. После кипячения пробы охлаждают под струёй проточной воды и колориметрируют (опыт и стандарт) против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм с зелёным светофильтром (длина волны 540 нм). Окраска растворов стабильна в течение 15 минут после снятия проб из бани. Результаты: количество мочевины в моче рассчитывают по формуле: С = (Еоп × Сст × А × 1,5) / Ест, где С – количество мочевины в суточной моче (ммоль/сутки); Сст – концентрация стандартного раствора мочевины (8,33 ммоль/л); Еоп – оптическая плотность опытной пробы; Ест – оптическая плотность стандартной пробы; А – разведение мочи; 1,5 – коэффициент пересчёта на среднесуточное количество мочи (у мужчин – 1,5 л, женщин – 1,2 л). Выводы: Техника безопасности:
РАЗДЕЛ 7. ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ РАБОТА 14. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ФЕНАНТРОЛИНОВЫМ МЕТОДОМ БЕЗ ДЕПРОТЕИНИЗАЦИИ Цель работы: ознакомиться с унифицированным колориметрическим методом определения мочевой кислоты. Задачи:
Мочевая кислота является конечным продуктом метаболизма пуринов в организме человека, у других млекопитающих она под действием уриказы расщепляется до аллантоина. Уровень концентрации мочевой кислоты в сыворотке и моче человека является важным показателем в диагностировании и контроле эффективности лечения таких заболеваний, как подагра, почечная недостаточность, лейкоз, врождённые дефекты ферментов распада пуриновых нуклеотидов. Принцип метода. Метод основан на восстановлении фенантролинового комплекса мочевой кислотой. Ход работы. В три пробирки вносят реагенты согласно таблице:
Примечание. Мочу перед проведением анализа развести в 10 раз физраствором. Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают при комнатной температуре точно 5 минут. Пробы колориметрируют против контрольной пробы при длине волны 490 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 (5) мм. Результаты. Концентрацию мочевой кислоты в крови рассчитывают по формуле: С = Еоп / Ест × 595 (мкмоль/л) или С = Еоп / Ест × 10 (мг%), где Еоп и Ест – экстинкции опытной и калибровочной проб, измеренные относительно контрольной пробы; 595 или 10 – концентрация мочевой кислоты в стандартном растворе в мкмоль/л или мг% соответственно. Концентрацию мочевой кислоты в моче рассчитывают по формуле: С = Еоп / Ест × 595 × 10× К (мкмоль/сут) или С = Еоп / Ест × 10× 10 × К (мг/сут), где Еоп и Ест – экстинкции опытной и калибровочной проб, измеренные относительно контрольной пробы; 595 или 10 – концентрация мочевой кислоты в стандартном растворе в мкмоль/л или мг%, соответственно; 10 – разведение мочи перед анализом; К – количество суточной мочи, л. В сыворотке здорового человека концентрация мочевой кислоты, определённая данным методом, составляет 238-506 мкмоль/л (4,0-8,5 мг%) у мужчин и 167-446 мкмоль/л (2,8-7,5 мг%) у женщин. В моче концентрация мочевой кислоты составляет 1490-4460 мкмоль/сут (250-750 мг/сут). Выводы: |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||